Nov trendy v bioorganickej chmii Svoju budcnos musme

Nové trendy v (bio)organickej chémii Svoju budúcnosť musíme tvoriť, lebo to za nás urobia iní. . . v rámci globalizácie. . . Nikto vám nepovie, či to čo robíte je dobré a zmysluplné. Všetci, čo tvoria, čakajú na ten svoj "super-nápad" alebo "super-ideu". Niečo také ako je napr. láska na prvý pohľad. Ale pocit vibráciíí neprichádza a neprichádza. Miesto neho počujete drzý vnútorný hlas: "Tento nápad je dobrá blbosť" alebo "Škoda času sa s tým babrať". Preto mnohí strávia celý život v čakárni. Čo keby ste si však povedali: "Aj tak to idem urobiť!"

Early Earth and the Origin of Life

odstup od problému s molekulárnym myslením neporovnateľne rýchlejší vývoj mikroorganizmov

Živý organizmus je vzorom nesmierne zložitej a virtuózne riadenej chemickej továrne. O priblížení sa k dokonalosti tohto systému sa súčasným chemickým inžinierom ani len nesníva. Prečo potrebujeme pochopiť biochémiu bunky? - aby sme pochopili systémy, v ktorých sa tieto bunky nachádzajú - pochopenie funkcie buniek súvisí so snahou ovplyvňovať ich funkciu metabolická mozaika - omiky primárne metabolity - typické pre všetky organizmy sekundárne metabolity - druhovo špecifické nízkomolekulové bioregulátory biomakromolekuly

Prečo by sa mali organickí chemici otravovať s biomakromolekulami, súvisiacimi novými činidlami a technikami? - nevyhnutnosť Mnohé biomolekuly sa nedajú pripraviť chemicky; problém znečisťovania životného prostredia - účelnosť Aj keď mnohé biomolekuly sa dajú pripraviť klasicky, kombinácia s biologickými metódami je jednoduchšia; chemoenzýmové syntézy, vzájomná kompatibilita biokatalyzátorov - príležitosť Syntetické transformácie v kľúčových oblastiach ako biochémia a molekulárna biológia sú dnes jasnou príležitosťou pre chemikov. Enzýmy sú tu, treba ich použiť! V súčasnosti "horúce" problémy pre chemikov prichádzajú z biológie.

Jean-Louis Reymond: The Chemical Space Project Acc. Chem. Res. , 2015, 48 (3), pp 722– 730

Some major databases for reaction, pathway and genomic information zoznam databáz v prvom čísle roka časopisu Nucleic Acid research

Vzťahy nie sú lineárne, preto potrebujeme účinné chemo-, bioinformatické techniky

Z hľadiska prípravy obvykle chápeme molekulu ako stabilný súbor atómov spojených kontinuálnou sieťou kovalentných väzieb. Zaoberá sa tým organická chémia, ktorá v totálnych syntézach dosiahla vysokú úroveň, napr. u komplexných sekundárnych metabolitov ako sú alkaloidy, steroidy, vitamín B 12, taxol. Syntéza komplexnejších biomakromolekúl je však oveľa zložitejšia a drahšia. Hoci biologické makromolekuly sa skladajú z kovalentných väzieb, sieť týchto väzieb nie je vždy súvislá, mnohé dôležité biologické štruktúry sú vlastne agregáty a nie jednoduché molekuly. Ich unikátna štruktúra a funkcia závisí od nekovalentných interakcií v agregáte, hlavne od hydrofóbnych, iónových a vodíkových interakcií. Príkladom môžu byť nekovalentné asociácie proteínov a ligandov, zvinovanie (folding) t. RNA, interakcie transkripčných faktorov s DNA alebo tvorba fosfolipidovej dvojvrstvy. Kým u nebiologickej organickej chémie sú nekovalentné interakcie sekundárne, u biologickej organickej chemie sú naopak tieto interakcie primárne. Preto ich pochopenie je veľmi dôležité pre nový typ organických syntéz - design a prípravu agregátov. Vyžaduje si to však úplne odlišný intelektuálny a technický prístup než klasická syntéza. U klasickej syntézy je dôležitá väzba a jej entalpia. Keď sa už vytvoria väzby a produkty, sú kineticky stabilné (hoci tiež môžu byť tvorené reverzibilnými procesmi). Výťažky sú značne menšie ako kvantitatívne. Odlišná je situácia u nekovalentných syntéz, ktorých produktom sú rovnovážne štruktúry, odrážajúce rovnováhu medzi entalpiou a entropiou.

Budúcnosť patrí na mieru šitým biokonjugátom komplikované problémy – dobre prešpekulované nástroje biokonjugát = bio + nebio = biomolekula, napr. nukleozid (špecifita interakcie) nebio = syntetická molekula (reakcia, detekcia) • nukleové kyseliny ako kľúčové ciele poznania, aj terapie • nukleozidy a nukleotidy ako zložky biokonjugátov • mnoho metód na prípravu biokonjugátov • potrebujeme metódy vhodné pre miniaturizáciu a automatizáciu biosenzory a laboratóriá na čipoch Med. Mot 2006 -04 -05

Prepojenie biologického a syntetického sveta Bioconjugate Chemistry

Couplingová reakcia riadená DNA (pseudointramolekulová r. )

Strategies to Control Reactivity The chemist’s approach to controlling reactivity + Starting materials m. M – M concentration One possible product Nature’s approach to controlling reactivity: n. M - M concentration Many reactants in one solution Macromoleculetemplated synthesis Selective product formation 21

Synthetic Strategies The chemist’s approach to active molecule discovery: Starting material Product Data: Keq, ee, IC 50, … Nature’s approach to active molecule discovery: DNA RNA Protein Selection, Amplification, Diversification 21

The Basics of DNA-Templated Synthesis (DTS) Reactant for DTS reactive group oligonucleotide linker General Reaction Scheme SH Annealing SH Coupling S 22

DNA-templated synthesis is sequence-specific and compatible with a wide variety of reaction conditions Reactions otherwise incompatible can be run in one pot, without detectable side-products, enabling the synthesis of large small molecule libraries Multistep syntheses can be performed selectively in one solution. This technique is still limited by compatibility with DNA backbone and aqueous conditions. Recently, DTS has been performed in THF, DMF, Me. CN and DCM with minimal amounts of water.

RNA: A Diverse Class of Molecules DNA r. RNA t. RNA Vault Y RNAs 7 SK Xist, H 19 RNA sn. RNAs sno. RNAs Guide RNA Introns 5’ UTR 3’ UTR Catalytic: Ribozymes Telomerase Viral RNAs Retrotransposons Micro. RNAs Non Coding RNAs: ‘Ribo Regulators’ (~97% of RNAs Present in Human Cells are Non-Coding)

Racionálny design alosterického ribozýmu

Aptazým

Alosterická selekcia nových motívov aptamerov a alosterických ribozýmov

Classification of Organic Synthesis Linear Synthesis -- tedious, inefficient, but could be simple (DNA, RNA, Peptide Synthesizers) Convergent Synthesis -- economic, time saving Divergent Synthesis -- SAR, Combichem Symmetry considered Synthesis -- simplification Systematic Synthetic Analysis and Design Biosynthesis driven Synthesis -- biomimetic synthesis

Linear Synthesis Convergent Synthesis

Divergent Synthesis - medicinal, combinatorial chemistry Template - scaffold with several attachment points - increases diversity

Symmetry Considered Synthesis Mc. Murry coupling JACS, 1974, 96, 4708

Strategies of Retrosynthetic Analysis 1. 2. 3. 4. Transform based approach : disconnection approach – need knowledge of rxn. Structure goal strategy : requires high imagination Topological strategy : simple rules to disconnect – no need to know rxn. Stereochemical strategy : linear compounds Ultimate Goal --- Computer Aided Synthetic Design

Biomimetic Synthesis

Biokatalýza – význam a postavenie na začiatku 21. storočia chémia - dominuje molekulárny prístup k zlúčeninám a reakciám chemické inžinierstvo - dominuje zamerianie na procesy so zlúčeninami biológia – dominuje systémový prístup k zlúčeninám na úrovni bunky nová trieda katalyzátorov – nie náhrada existujúcich

BIOKATALÝZA SUBSTRÁT - veľké možnosti modifikácie substrátu BIOKATALYZÁTOR - screening - riadená evolúcia - príprava nadproducentov enzýmov - abzýmy - katalytické protilátky REAKČNÉ PODMIENKY - reakčná teplota (termofily, psychrofily) - výber rozpúšťadla - inhibítor (viacfázové systémy) organické rozpúšťadlá superkritické kvapaliny (CO 2, etán, etylén, CHF 3, SF 6) iónové kvapaliny - adsorbenty

Enzým je katalyzátor aj regulátor

The Chemoselectivities of the Enzymes

Schematické porovnanie kultivačného a metagenomového prístupu

Abzýmy

ABZÝMY Nová generácia umelých enzýmov – katalytické protilátky

Nanogold – DNA - proteín

Syntetická biológia

Automated Oligonucleotide Synthesizers

Overall Yield vs. Coupling Yield

Modulation of p. Ka and redox potential of tyrosine residues A) The RNR reaction converting ribose to deoxyribose relies upon a catalytic cysteine radical. The generation of this radical is dependent on radical formation on several key tyrosine residues. Altering the p. Kas and redox potentials of these residues affords key insights into the catalytic mechanism. B) Examples of nc. AAs conferring altered tyrosine p. Kas and reduction potentials (E p ) that have been employed in the study of ribonucleotide reductase.

Modes of action of antisense oligonucleotides Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33, 533– 540

Porovnanie antisense stratégií

Príklady použitia FRET techniky v biologických experimentoch membrány

Príklad duálneho FRET "molecular beacon" systému pre in vivo detekciu špecifických m. RNA A všade potrebujeme vhodne modifikované nukleozidy. . .

Intrastéricky inaktivovaný inhibítor-DNA-enzým (IDE) konjugát a jeho aktivácia komplementárnou DNA. Môže sa použiť ako senzor na malé množstvá DNA, pretože má zabudovanú schopnosť amplifikácie signálu.

Principle of Microarray (Chip) Assay Prehybridization Synthetic DNA probes Posthybridization Probes with hybridized DNA

Klasifikácia senzorov

Princíp elektrochemického DNA biosenzora využívajúceho sendvičovú hybridizáciu DNA

DNA čip využívajúci sendvičovú hybridizáciu a elektrickú detekciu

DNA SET transistor DNA Single electron transistor Main strand Gate strand Equivalent Electrical Circuit E. Ben-Jacob , Phys. Lett. A 263, 199 (1999). Main strand

Chemical bonds in DNA can act as tunnel junctions in the coulomb blockade regime, could emit electricity, given a proper coating. Has the ability to coat a DNA strand with metal in nm scale. Schematic image with 2 grains in DNA connected by P-bond. Dark circle - carbon atoms, white circles - oxygen atoms.

Kvantové bodky (Quantum dots) sú fluoroforom podobné, niekoľko nanometrov veľké častice polovodičových materiálov Cd. Se, Cd. Te, In. P, In. As. Podľa veľkosti častíc a chemického zloženia sa pripravujú pre rozsah 400 -2000 nm s fluorescenčným kvantovým výťažkom až 85% pri RT. Perspektívne môžu nahradiť fluorofory v mnohých biotestoch, pretože ich emisná účinnosť neklesá s časom ako je to u fluoroforov. Podobne ako fluorofory sa môžu konjugovať s biomolekulami. - emisia viditeľného svetla z vybraných kvantových bodiek v roztoku. Emisná vlnová dĺžka sa vybrala podľa typu materiálu a veľkosti častíc - relatívna emisia červených kvantových bodiek versus fluorescenčné farbivo. Texas Red ožarované počas 2 min. Emisia farbiva sa znižuje v dôsledku fotochemických zmien vo farbive (photobleach).

Konjugácia QD k biomolekulám

Porovnanie emisných spektier kože myši a QD, získaných za rovnakých exitačných podmienok, demonštrujúc tak, že QD signály možno posunúť do spektrálnej oblasti s minimálnou autofluorescenciou. Obrázky vpravo ilustrujú in vivo imaging lymfatických uzlín a tumoru prostaty.

AFM - Atomic Force Microscopy CFM – Chemical Force Microscopy

AFM testuje intermolekulové sily medzi špičkou sondy a povrchom. Merané sily sú výsledkom fyzikálnych, chemických, elektrostatických alebo magnetických interakcií. Mapovaním síl nad analyzovaným povrchom sa vytvorí image analyzovaného objektu. AFM meria opticky výchylku ostrého kremenného hrotu, ktorý sa nachádza na konci výkyvnej konzoly, pričom dostaneme image vzorky v atómovom rozlíšení. Laser (červený), ktorý sa odráža do detektora meria veľmi malé rozdiely tlaku spôsobeného interakciou špičky a vzorky. Priestorové rozlíšenie je funkciou ostrosti špičky; ostrosť sa môže podstatne zlepšiť pripojením alebo vyrastením na konci próby uhlíkových nanorúrok (carbon nanotubes) s priemerom len pár nanometrov. CFM používa chemicky modifikované špičky na meranie image a biochemických interakcií. Obrázok c ukazuje špičku konjugovanú s väzbovou skupinou, ktorá bude mapovať lokalizáciu komplementárneho receptora. CFM sa aplikovala na meranie väzby ligandov, mechanickú odozvu molekúl a dokonca na meranie enzýmovej aktivity. Obrázok d ilustruje možné vysoké rozlíšenie na 155 nm scane dvoch lineárnych ds. DNA navzájom sa prekrývajúcich.

Schéma typického SPR (surface plasmon resonance) experimentu

Mikročipy malých molekúl (small-molecule microarrays) (a) detekčná stratégia pomocou hydrolytických enzýmov (b) stratégia screeningu inhibítorov v roztoku Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9: 4– 13

Fluorescenčný test pre glykozyltransferázy CHEMOSENZOR

Integrácia diagnostiky a terapie - nový trend v biotechnológii Molekulárna diagnostika - detekuje patogénne mutácie vo vzorkách DNA a RNA - detekuje, diagnostikuje, subklasifikuje, predpovedá a sleduje odpovede na terapiu - zahŕňa moderné techniky molekulárnej biológie - lokalizuje, identifikuje a charakterizuje gény zodpovedné za ľudské choroby - PCR je vďaka univerzalite a flexibilite v súčasnosti zlatým štandardom molekulárnych testov - viac ako 80% súčasnej diagnostiky sa orientuje na infekčné choroby

Abstrakcia Ø dôležité a menej dôležité časti molekuly, reakcie, projektu Ø modularita – jednoduchšie subproblémy Ø hľadanie alternatívnych riešení Ø schopnosť nájsť podobnosť u odlišných objektov Ø (mozgová) aktivita majstra bioorg-fu verzus začiatočníka Ø opakovanie je príležitosť (preprocessing) Ø poznajte možnosti a limitácie svojich nástrojov abstrakcie