Northern blotting RNA isolation Probe labeling AAAAAA d

Northern blotting RNA isolation Probe labeling AAAAAA d. CTP d. GTP d. TTP d. ATP p. BS-Sema. III Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography

reverse Northern blotting Northern reverse Northern

c. DNA arrays (continued) • macro-arrays – low-density – filter-supported – radioactive probes (duplicates) – low sensitivity – only c. DNA clones spotted – cheap

c. DNA arrays (continued) • micro-arrays – high-density – glass-supported – fluorescent probes (single slide) – high sensitivity – ability to spot oligonucleotides – very expensive

Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale In questo esempio i c. DNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia. I microarrays Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di c. DNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un c. DNA corrispondente a tale gene.

Microarray technology Probes Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking” http: //www. ym. edu. tw/excellence/HBP_CP 4/procedure. htm

Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti. E’ necessario estrarre le molecole di m. RNA dai due campioni.

Arrays Probe DNAs are “spotted” onto a glass slide Each spot corresponds to a particular gene e. g. β-actin Each array will have thousands of spots (typically 3000 to 30000)

reference test RNA is extracted from tissues Targets m. RNA c. DNA or cells RNA is copied to DNA labelled DNA is fluorescently labelled pooled Samples are pooled

Hybridisation Labelled target DNA hybridised to array Fluorescence of each spot indicates how much of particular RNA was present in both samples

Hybridised Array Data Processing Further analysis Scanner Images Normalised Ratios Normalisation Spot-finding Ratios

Cy 3 Cy 5 test reference Cy 3 Cy 5

Spot-finding (1) Software identifies grid of spots and maps individual spot locations

Estrazione dell’m. RNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare Conversione in c. DNA Marcatura con 2 fluorocromi diversi Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi (1) (2) (3) (6) Immagine a colori raffigurante il microarray Eccitazione della fluorescenza tramite laser Riconoscimento (4) tra i c. DNA provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray (5)

STUDIO DEI PROMOTORI: siti di legame dei fattori di trascrizione EMSA

Trans Factor Methods: EMSA

Trans Factor Methods: EMSA Electromobility “Shift”

Trans Factor Methods: Consensus Sequence Capture

Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine anticorpo

Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine • Competizione con stesso sito, sito analogo, sito mutato • Identificazione dei fattori coinvolti tramite “supershift” con anticorpi Lodish Figure 10 -7

Il footprint con DNasi I permette di localizzare il sito di interazione tra proteina e DNA Lodish Figure 10 -6