NO a la disfuncin endotelial Algo mas que

. NO a la disfunción endotelial… Algo mas que una negación Dr. Armando Rojas Rubio Escuela de Medicina, Universidad Católica del Maule.

Una premonición al estilo de Leonardo Da Vinci “…Envejecemos en la misma medida que lo hace nuestro endotelio…” Dr. R. Altschul. , 1954. Endothelium. The Mac. Millan Company, New. York, pp. 1– 155.

Endotelio vascular ØOcupa un área equivalente a 6 canchas de tenis (adulto 70 Kg. ) ØPeso total ≈ 1. 5 Kg. ØMasa celular compuesta por ≈ 1 trillón de celulas endoteliales Su importancia no esta condicionada por factores cuantitativos sino cualitativos

Funciones del endotelio vascular Control vasomotor Control crecimiento y migración CML Producción y liberación de sustancias vasoactivas Inhibición de la agregación plaquetaria Transducción de fuerzas mecánicas Permeabilidad Migración células Superficie antitrombótica mononucleares y PMN profibrinolítica Adhesión células mononucleares y PMN

Surgimiento del término disfunción endotelial Comienzos de los 70 Finales de los 70 Aceleración del proceso aterosclerótico por remoción de la capa endotelial Endotelio morfológicamente intacto en zonas de lesiones ? “Disfunción Endotelial” Michael Gimbrone Jr. J Card Surg 4, 1989

Disfunción endotelial y Biología vascular. Un vínculo indisoluble Ø Ø Ø Papel paracrino y endocrino del endotelio (ECA, PGI, NO, endotelinas etc) Anormalidades vasomotoras (vasoespasmo coronario por angiografía, vasoconstricción paradójica a ACh (*) Inflamación, aterosclerosis (Intensa acumulación de células mononucleares en sitios de lesión, VCAM-1 como molécula prototipo contraligando VL-4) Oxidación y regulación vascular (Oxidación de LDL, producción de EROs asociada con respuestas inflamatorias en los vasos , Inactivación del NO por ROS, estatus redox intracelular y activación de NFk. B. Papel protagónico de mecanismos basados en cambios redox). Fisiología y Biología molecular y celular de Angiotensina II; (SAVE y SOLVD (IECA); Ang II inductor de estrés oxidativo y marcada actividad proinflamatoria).

¿Que se define por disfunción endotelial ? Disfunción Endotelial: Primer cambio fenotípico de la vasculatura expuesta a factores de riesgo aterotrombóticos (●) Sentido Estrecho (*) Marcada disminución en la síntesis/biodisponibilidad de NO. Sentido Amplio Se adiciona un estado de activación del endotelio (●) Dr Joseph Loscalzo, Instituto Cardiovascular Whitetaker, Boston, USA

Factores de riesgo y consecuencias de la disfunción endotelial Factores de riesgo tradicional Factores no tradicionales Predisposición genética Factores locales Factores desconocidos Disfunción endotelial Lesión y remodelado vascular Inflamación Vasoconstricción Trombosis

Bases moleculares y mecanismos involucrados en el origen de la disfunción endotelial.

Estrés oxidativo. Un denominador común hipertensión dislipidemia diabetes hábito de fumar Estrés oxidativo O 2 - H 2 O 2 ↓NO EROs . OH Endotelio disfuncional . ↑ONOO-

Fuentes de EROs en la vasculatura NADPH oxidasa • Ang II, ET-1, Trombina • IL-1, TNF-α • PDGF, IGF, EGFNOX-4 • Ocupación de LOX-1 • Fuerza de distensión parietal gp 91 phox p 67 p 40 O 2 anti-gp 91 phox anti-tubulina p 22 p 47 Citoesqueleto. Rac O 2 • Xantina oxidasa • Respiración mitocondrial • Ciclooxigenasa • Lipooxigenasa • Citocromo P 450 • NOS III disfuncional

Interacción de EROs con sistemas de señalización y consecuencias en la vasculatura ↑EROs + + Factores Trasncripción Ca 2++ NFk. B, AP-1, intracelular STAT + - Tirosina cinasas Tirosina fosfatasas + MAP Cinasas JNK, p 38 MAPK ERK 1/2 Control Expresión Crecimiento celular/apoptosis vasomotor genes pro. Permeabilidad inflamatorios Vascular Óxido nítrico Control vasomotor

Oxido nítrico (NO. ): Un mediador clave en la funcionalidad vascular -Nitrosilación ODC -↓Ciclina/cinasa dependiente de ciclina -↑ GMPc Proliferación y -↓Ca+2 migración CML -↓P-selectina -Conformación GPIIa/IIIb Regulación NFk. B -Nitrosilación de IKKβ -Resíntesis de Ik. B Anti-inflamatoria Anti-plaquetaria NO. Anti-apoptosis Pro-fibrinolítica -Inhibición caspasas 3 y 9 -desestabilización ARNm MKP-3 (impide degradación Bcl-2) -↓expresion PAI-1 -↓TF

Algunas características y estructura de dominios de la NOS III • Enzima responsable de la formación de NO en el endotelio vascular 1203 aa, PM 133 k. Da • Región promotora con secuencias de unión a diversos FT. • Muy compleja regulación post-transcripcional • Formación de complejo multimolecular (NOSosoma) -Serina 1177 (Akt , regulación positiva) NH 2 Oxigenasa FAD FMN NADPH -Treonina 495 (PKC, regulación negativa) -Serina 114, (ERK 1/2 ? ) -Serina 633 (PKA, PKG, ↑ accesibilidad Ca. M Acilación Arg Zn BH 4 Hemo -Miristilación (glicina 2) -Palmitilación (cisteína 15 y 26) Reductasa Flujo de electrones COOH

La caveola… el compartimento celular perfecto. VEGF Acetilcolina, Bradikinina Serotonina Membrana plasmática Fuerzas de fricción tangencial caveola Ca+2 CAT-1 Sistema de reciclaje citrulina/arginina citoesqueleto Cav-1 NOS III proteína G

Visión panorámica de la activación de NOS III Fuerza de fricción Estrógeno-R Esfingosina-1 -P Bradicinina VEGF-R tangencial αi β γ αs β γ ? PLC-γ Ptd. Ins(4, 5)P 2 Ins. P 3 AMPc Ca 2+ Ca. M DAG Ca. MK Akt PKC ? oxigenasa S 116 T 497 Ca. M reductasa S 635 NOSIP S 1177 LAI CHIP Hsp 70 Ca. M Hsp 90 NOSTRIN PKA S 617 G 2 C 15 C 26 citoesqueleto ATP AC PI 3 K Hsp 90 NOS III inactiva NOS III Cav-1 pori n L-arginina NO . GC Cav-1 Din activa Signaloma “NOSosoma”

Disminución en la biodisponibilidad de NO. Principales mecanismos Cambios en la biodisponibilidad Disminución en la síntesis/actividad. ØInteracción del NO con O 2ØInhibidores endógenos ØDisponibilidad de sustrato//cofactores Cambios en la expresión /estructura Ø Desestabilización del ARNm ØDisminución transcripción ØPolimorfismo gen NOS III

Interacción de NO. con EROs NO . NOS III 6. 7 x 109 M-1 s -1 ONOO - O 2 - ≈ 2 x 109 M-1 s -1 H 2 O 2 “Desacoplamiento de NOS III” Cu. Zn SOD Mn SOD ec. SOD NADPH oxidasas

Inhibidores endógenos: Origen y relevancia fisiológica de argininas metiladas -Dimetilarginina asimétrica (ADMA) (JBC 245, 1970) Proteínas portando ADMA y monometilarginina (NMA) hidrólisis ADMA y NMA libres Excreción renal Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa II (DDAH) Citrulina + metilaminas -ADMA, inhibidor competitivo de NOS III, antagoniza vasodilatación dependiente de endotelio (Lancet 339; 1992)

Baja disponibilidad de sustrato La “paradoja” de la L-arginina. Aparente discrepancia entre las diferencias reportadas para la concentración intracelular de L-arginina (1 -2 m. M) y la Km de la NOS III (2. 9 µM) Teóricamente: NO se puede incrementar la síntesis de NO por L-arginina exógena Experimentalmente: SI se puede incrementar la síntesis de NO L-arginina exógena CAT-1

BH 4. La clave en el control de la divergencia funcional de la NOS III: NO. ó O 2 Estabilización unión L-arginina Transferencia de e- desde BH 4 Mantenimiento forma dominio reductasa redox activa grupo Hemo Formación de homodímero estable §Hipercolesterolemia §hiperglicemia §hipertensión BH 4 exógena + §inflamación _ NOS III Oxidación BH 4 L-arginina O 2 - “Desacoplamiento” NOS III NO. ONOO-

Disminución de la trascripción/ Desestabilización ARNm NOS III ØDisminución actividad transcripcional (Evento raro) ØDisminución t 1/2 ARNm (El mecanismo común) Proteína NOS III ARNm NOS III 3’ UTR Degradación ? PIDE: Proteína Inductora de Disfuncionalidad Endotelial (50 -60 k. Da)

Disminución del t½ ARNm NOS III ≈70 -80 hrs ≈ 20 hrs Rojas et al. , Circulation Research, 86: 50 -54, 2000

Polimorfismo en el gen NOS III. Polimorfismo 1. - Exón 7…. . G 984 →T Consecuencia Glu 298 → Asp ↑susceptibilidad degradación 2. - Región 5’ flanquenate …. T 786→C ↓síntesis NO 3. - Intrón 4…. . 4 -5 repeticiones en tandem de 27 bp ↓síntesis NO Asociación con espasmos coronarios, IM, hipertensión

Factores de Riesgo de Disfunción Endotelial. Contribución etiopatogénica Hiperhomocisteinemia dislipidemia Infección/ inflamación Déficit estrogénico HTA DE Tabaquismo Hiperglicemia

Hipermocisteinemia y DE ↓ BH 4 ↑actividad DDAH II ↓actividad CAT-1 ↓niveles de Cav-1 ↓ expresion ec. SOD HOMOCISTEINA Auto oxidación ↑NFk. B O 2 - ↓ NO. ↑ VCAM ↑ Factor Tisular

Dislipidemia y DE ox. LDL HDL ox. LDL SR-B 1 LOX-1 NO. NADPH oxidasa • ↑ET-1 • ↑PDGF • ↑M CP-1 • ↑ IL-8 • ↑VCAM-1 • ↑ICAM-1 • ↓Trombomodulina ↑O 2_ NOS III Treo 497 src P NFk. B NOS III desacoplada PI 3 K Akt

Infección/inflamación y DE Infección /inflamación Enfermedad cardiovascular Disfunción endotelial C. pneumoniae CMV H. pylori HIV Enfermedad periodontal Vacuna S. thyphi TNF-α PCR ↓estabilidad ARNm NOS III ↓ biodisponibilidad NO Disfunción endotelial .

Déficit estrogénico y DE Ateroprotección Estrógeno -Complejo de acción rápida Receptor α-NOS III -Control de EROs E 2 ER-α NOS III Hsp 90 Gαi + + + Ca 2++ P Akt MAPK NO. -Genómico: ↑ actividad transcripcional ↓expresión ↑ expresión de NADPH oxidasa Mn SOD y ec. SOD EROs

Hiperglicemia y DE Hiperglicemia ↑PKC ↑PAGs ↑via aldosa reductasa §↑expresión y actividad NADPH oxidasa §↑oxidación de BH 4 §↓ estabilidad ARNm NOS III §↓ fosforilacion de NOS III EROs NO . ↑ via hexosamina

Tabaquismo y DE Tabaquismo (humo de cigarrillos) ↓actividad Mn. SOD ↑expresión ET-1 ↓ niveles prostaciclina ↑producción EROS Endotelio Disfuncional ↓actividad NOS III

Hipertensión y DE Hipertensión Incremento de EROs §↑ NADPH oxidasa. §↑xantina oxidasa. §Polimorfismo -930 A/G p 22(phox). Activación sistema renina-angiotensina ↓Biodisponibilidad NO §↑ Ang II EROs NO . . §Oxidación de BH 4 §Desacoplamiento NOS III §Polimorfismo NOS III

¿Es tratable la disfunción endotelial?

EROS y disfuncionalidad endotelial Rojas y cols, Curr. Vasc. Pharmacol. , 2006

Biodisponibilidad de NO y mantenimiento de la homeostasis vascular Factores causales Inhibidores endógenos ↓Niveles de L-Arg y BH 4 Eliminación de NO ↓Expresión de NOS III Biodisponibilidad Reducida Enfermedades vasculares Rojas y Morales, Arch Med Res 35 , 2004 Intervención terapéutica Administración de L-Arg y BH 4 Antioxidantes Estatinas Fármacos cardiovasculares Terapia génica Biodisponibilidad Mejorada Recuperación vascular

Estrategias terapéuticas. Una aproximación multifactorial Antioxidantes Antagonistas Receptor AT 2 Ejercicio físico ↑NO . /↓O 2 Inhibidores ECA Miméticos SOD Estatinas

Antioxidantes estructuralmente no relacionados Vitamina C Probucol SOD glutatión Aumento de la vasorelajación dependiente de endotelio

Estatinas: Mucho mas que inhibidores de la HMGCo. A reductasa ↑Akt ↑ NOS III ↑diferenciación CE circulantes ↑GTP Ciclohidrolasa I ARNm ESTATINAS ↑actv. enz Tioredoxina ↓NADPH oxidasa ↓prepro. ET-1 ARNm ↓Receptor ET-1 CML (ETA)

Inhibidores de ECA y biodisponibilidad del NO La efectividad de un mecanismo dual. Inhibición ECA ↓ Angiotensina II ↑ Bradicinina ↓ síntesis de O 2 - ↑ síntesis de NO ↑ biodisponibilidad NO. .

Antagonistas del receptor AT 1 Ang II AT 1 §Vasoconstricción §Activación NADPH oxidasa §Actividad promotora de crecimiento Endotelio disfuncional AT 2 §Vasorelajación §Activación NOS III §Liberación BK endógena §Modulador del crecimiento Endotelio funcional

Miméticos de SOD. Una opción emergente SOD antigenicidad proteólisis inestabilidad Complejos macrocíclicos de Mn (II) Aumento de la biodisponibilidad de NO in vivo e in vitro

Ejercicio físico regular. Aktivemos nuestra NOS III Ejercicio físico regular ↑ flujo sanguíneo ↑expresión SODec; Cu. Zn SOD ↑Fuerza de fricción tangencial NO. ↑Akt ↑fosforliación NOS III (Ser 1177) NO. célula endotelial CML

Los enfoques mas recientes… §La conexión adipocito-célula endotelial: Adiponectina y Resistina Adiponectina: -Aumenta produccion NO, (fosforilación 1177 Ser). -Bajos niveles de adiponectina correlacionan con ↓VDE. -Inhibición activación NFk. B Resistina: -Aumenta expresión ET-1, VCAM-1 y MCP-1 § Disfunción de células endoteliales progenitoras -Hiperglicemia disminuye la capacidad de neovascularización de CEP

§Ligandos de PPAR y biodisponibilidad de NO. PPAR subtipo α γ Ligandos sintéticos Fibratos Efecto sobre el balance. NO /O 2 - en el endotelio ↓actividad NADPH oxidasa, ↑ expresión NOS III Tiazolidinedionas ↓actividad NADPH oxidasa, ↑ expresión NOS III Telmisartan ↑actividad catalasa

Conclusiones §Disfunción endotelial: -Primer cambio fenotípico sistémico del endotelio vascular sometido a factores de riesgo aterotrombóticos. § Entidad compleja: -Alta variabilidad de factores etiopatogénicos §Principal característica: -Incremento de estrés oxidativo y la consecuente disminución de la biodisponibilidad de NO. § Biodisponibilidad NO: - Inactivación de NO, disminución en la actividad NOS III, cambios en la expresión y estructura. §Reversibilidad: §Valor pronóstico: - Alta potencialidad de intervención terapéutica -”Barómetro de riesgo cardiovascular”. Elemento predictor independiente de eventos cardio- y cerebro-vasculares.