Nagyfelolds Mikroszkpia Dr Szab Istvn 11 Optikai mikroszkp

Nagyfeloldású Mikroszkópia Dr. Szabó István 11. Optikai mikroszkóp TÁMOP-4. 1. 1. C-12/1/KONV-2012 -0005 projekt „Ágazati felkészítés a hazai ELI projekttel összefüggő képzési és K+F feladatokra"

11. Optikai mikroszkóp • Elmélet – Az optikai mikroszkóp leképezési módjai – Szuper-felbontású mikroszkópia – Lencse nélküli mikroszkópiás rendszerek • Gyakorlat – Mikroszkópos képek feldolgozása • Segédanyagok

Történeti fejlődés • Négy évszázados történet • Aktív fejlesztés napjainkban is • Az egyik legszélesebb körben használt kutatási eszköz „Molecular Expressions Microscopy Primer: Museum of Microscopy”. [Online]. Elérhető: http: //micro. magnet. fsu. edu/primer/museum/index. html

Történeti fejlődés 1. Középkor: olvasó kövek, okullárok 1590 Janssesn kétlencsés mikroszkóp 9 x 1674 Leeuwenhoek 270 x objektív, sejtek 1833 Brown pollen – Brown mozgás (atomi ütközések hatása , Einstein 1905) • 1876 Abbe diffrakciós elmélete • 1886 Abbe – Zeiss diffrakció limitált mikroszkóp • •

Történeti fejlődés 2. • 1930 Lebedeff Interferrencia mikroszkóp • 1932 Zernike fáziskontraszt mikroszkóp • 1952 Normanski differenciális interferencia kontraszt mikroszkóp (DIK) • 1968 Gábor Dénes, holográfia • 1983 Sedat & Agard 3 D mikroszkópia „wide field”+deconvolúció • 1980 - Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp • 2000 - Az Abbe-határ áttörése: PALM, STED, SI

Leképezés - alapok Az azonos szögben induló sugarak a hátsó fókuszsíkban találkoznak. A tárgy egyes ponjaiból kiinduló sugarak töltik ki a hátsó appertúrát

Véges / Végtelen – konjugált leképezés Véges konjugált kép távolság: továbbító lencséket igényel, régebbi objektívek Végtelen konjugált kép távolság: egy csőlencsét igényel, modern objektívek

Megvilágítás • Köhler megvilágítás – A fényforrás minden pontja egy párhuzamos nyalábot hoz létre a minta felületén – Egyenletes megvilágítás egyenetlen fényforrás esetén is • Kritikus megvilágítás – A fényforrás leképeződik a minta felületére – Tökéletesen egyenletes fényforrás esetén használható

Objektív Alaptulajdonságok • Nagyítás • Numerikus Apertura • Véges / Végtelen konjugált • Fedőlemez vastagság / Ha van • Immerziós folyadék • munkatávolság

Színhiba korrekció

Látómező görbület Planáris objektív (komplex, de fotomikroszkópiához szükséges

Geometriai torzítás Sugár irányban változó torzítás Párna Hordó A torzítás származhat a szemlencsétől.

Hullám Optika • Az apertúra diffrakciós képe a végtelenben, illetve a lencse által leképezve keletkezik: Korong: Bessel fv. Airy minta

Felbontás a hullám képből Numerikus apertúra :

Felbontási kritérium

Numerikus Apertúra Munkatávolság Immerziós folyadék NA kisebb, mint a legkisebb törésmutató a lencse és a tárgy közt! (sin<1)

3 D felbontás • Pontforrás diffrakció limitált képe (3 D PSF = Point Spread Function) • Fókuszmélység geometriai optika és diffrakció limitált

Kontrasztot rontó tényezők Ideális: Háttér nélkül Valódi: Szóródott háttéren Aberráció: A kontraszt ellensége • Kromatikus • Görbült fókuszsík • Torzítás • Szférikus aberráció • Asztigmatizmus • Kóma

Optikai átviteli függvény Térbeli frekvencia: periódus/méter Felbontási határ Interaktív animáció

Megvilágító apertúra szerepe A megvilágító apertúra növelése növeli a felbontást, de csökkenti a kontrasztot

OTF és PSF kapcsolata Interaktív animáció

3 D OTF A NA csökkentése gyorsabban rontja a tengely irányú felbontást: 2 D kép esetén ez nagyobb mélységélességet jelent!

Az optikai mikroszkóp leképezési módjai

A fény anyag kölcsönhatás leírása • Fénysugár – Geometriai Optika – Törés – Visszaverődés • Elektromágneses hullám – Hullám Optika – Interferencia – Diffrakció – Polarizáció • Foton - Kvantált fény-anyag kölcsönhatás – Abszorpció – Szóródás – Fluoreszcencia • Kvantum hullám - Kvantum Optika – Nem klasszikus fényforrások, összefonódás, zaj csökkentés – Lézer, fotonikus kristályok, közeli tér gerjesztések

Mikroszkópiás alkalmazások • Törés, visszaverődés • Elnyelődés: – fény indukált reakciók: lágyulás, aktiválás – Fény indukált melegedés: elnyelés, fotoakusztika – Fény indukált fény • • Szórás, diffrakció Sugárnyomás : Optikai csipesz Fázis eltolódás : interferencia Szín eltolódás : fluoreszcencia

Néhány mikroszkópiás rövidítés Rövidítés Angol kifejtés SDM Spinning Disk Microscopy +Decon 3 D Deconvolution Microscopy LSCM Laser Scanning Confocal Microscopy CLEM Correlated Light and Electron Microscopy FCCS, FCS Fluorescence (Cross -) Correlation Spectroscopy SPIM Selective Plane Illumination Microscopy FRET/FLIM Fluorescence Forster Resonance Energy Transfer/Life Time imaging 2 P, (2 PE, 3 P) Two-Photon/Multi-Photon Excitation Microscopy SI Structured Illumination Microscopy

Kontraszt létrehozásának módjai • Világos terű mikroszkópia: A minta abszorpciója • Fáziskontraszt mikroszkópia: Az optikai útkülönbség • Sötét látótér: Csak a szórt fényt képezi le • DIC (Differeciális Interferencia Kontraszt): A helyi optikai úthossz különbség • Polarizáció (A polarizáció változását jeleníti meg: kettőstörő anyagokra

Fázis kontraszt mikroszkóp A mintán szóródott és a környezetében irányváltozás Nélkül áthaladó nyaláb közt hoz létre fázistolást, -

Sötét látótér • Csak a szórt fényt engedi át: a kondenzer egy fénykúppal világítja meg a mintát, ami nem képeződik le szórás nélkül.

DIC • Egymásra merőlegesen polarizált, eltolt nyalábokkal világítja meg a mintát, amelyeket a leképezés során visszafordít és visszatol. A lokális fáziskontrasztot képezi le az eltolás irányában. • A kontraszt irányfüggő és kiemeli az éleket. Az egyik él világosabb, a másik sötétebb, így 3 D jellegű a kép

DIC felépítése

Fluoreszcens mikroszkópia • • • Nagy kontraszt Specifikus, több színű jelölés Élő sejtek vizsgálata Kvantitatív eredmények Érzékelőként is funkcionálhat [Ca], p. H, … Fluoreszcencia: Gerjesztő fénytől eltérő, nagyobb hullámhosszú fény kibocsátása

Fluoreszcens spektrum

A gerjesztett molekula „Felmelegszik” megnő a rezgési energiája Fényt bocsájt ki Kémia reakcióba léphet (fotokémia) Átadhatja az energiáját nem destruktív módon (fotoszintézis) • Triplet állapotba kerülhet (foszforeszcencia) • •

Fluoreszcencia és foszforeszcencia

Szinglet és triplet állapotok LUMO Hund szabály: A triplet alacsonyabb energiájú HOMO Spin átfordulás tiltott a momentum miatt. Hosszú élettartamú meta-tabil állapot

Időskálák

Sok száz fluoreszcens molekula Problémák: Bomlás a gerjesztés hatására Spektrum eltolódás „Kifagyás” a környezet hatására Telítődés Széles spektrum Mérgező

Quantum pöttyök Félvezető nanokristály Kis méret : kvantum bezárás Polimer védő bevonat Fotostabil Keskeny, stabil spekrum „Nagy” 5 nm + burok Pislogás / Ki be kapcsolhat

Szűrők • A gerjesztő és a fluoreszcens fény intezitásarány 106 lehet

Szuper-felbontású mikroszkópia

Felbontás javítás széles sugarú leképezésnél • Abbe-határ elérésének feltétele – Homogén törésmutatójú közeg – Nagy jelerősség – Minimális háttér intezitás • Jel/zaj arányt rontják a gyakorlatban: – Optikai aberráció – Fókuszon kívüli elmosódás • Fókuszsorozat használata, a PSF segítségével utólagos dekonvolúció széles látótér mellett! – Kép kontraszt javul – Kis mértékű felbontás javulás

Felbontás javítás Konfokális pásztázó mikroszkópia CLSM esetén • Fókuszált lézer nyaláb pásztázza a mintát • Csak a fókuszsíkból érkező fény jut a detektorba (fotoelektron sokszorozó, lavinadióda) • A felbontás javításához a fényáteresztő lyuk méretének jelentős csökkentése kell, ami drasztikusan lecsökkenti az átjutó fényintenzitást.

Kommerciális nanoskálás távoli tér optikai mikroszkópia felbontása

Elvi alapok Moiré effektus révén a nagyfrekvenciás minta és világitás moduláció komponensek interferrenciája alacsony frekvenciás információt eredményez, ami leképezhető. A fluoreszcencia kioltása egy másik Nyalábbal. A világító tartomány a Nemlinearitás miatt a diffrakciós Határ alatt marad. Nagy számú mérés átlagolásával a fluoreszcens molekulák helyének mérési pontosságát statisztikusan megnöveljük!

Módszerek leírása Módszer Leírás CLSM Confocal Laser Scanning Microscope A pásztázott térfogat csökkentése, strukturált megvilágítás STED CW-STED Simulated Emission Depletion Continious Wave STED A gerjesztő és kioltó lézernyalábok nemlineáris együttes hatása lecsökkenti a fluoreszcens folt méretét. 3 D-SIM 3 D Structured Illumination Microscopy Interferrenciával létrehozott különböző térbeli frekvenciájú megvilágításokkal alul mintavételezett jelből matematikai rekonstrukció PALM/STORM Single molecule localisation and composition Az egyes fluoreszcens molekulák helyének ismételt mérésével és átlagolásával javított felbontás érhető el.

Szuper feloldású fluoreszcens mikroszkópia

Lencse nélküli mikroszkópiás rendszerek

Holográfiai elvek • Gábor Dénes az elektronmikroszkóp felbontásának növelésére • A fázis és amplitudó információk együttes rögzítése analóg módon referencia nyalábbal létrehozott interferenciával • Optikai elterjedése a koherens lézer fényforrások megjelenésével következett be • A leképezéshez nincs szükség lencsére, mivel a hullámfrontot rögzítjük és rekonstruáljuk

Digitális holográfia • A holografikus képet digitális képsorozatként rögzítjük, a tárgyat számításokkal rekonstruáljuk. • 3 D képalkotás lehetősége • Utólagos fókusz választás • Nagy felbontás esetén objektív lencsét használunk, a lencsehibák utólag korrigálhatóak. • Digitális holográfia koherens és inkoherens megvilágítással is megvalósítható

Digitális Holográfiás Mikroszkópia • Koherens fényforrás • Interferrométer • CCD kamera Reflektív minta Alapvető kérdés a CCD felbontása Átmenő világítás

Interferrometriás képalkotó módszerek • Fáziskontraszt mikroszkópia • Differenciál Interferencia kontraszt mikroszkópia • Pásztázó interferometria – optikai profilométer • Specle Holográfikus leképezés • Inkoherens digitális lencse nélküli leképezés

Mikroszkópos képek feldolgozása Gyakorlati feladatok

Optikai mikroszkópiás vizsgálatok • • • Ismerkedés az optikai mikroszkóppal Képalkotási módok alkalmazása Felvételek készítése Mikroszkópos felvételek feldolgozása Mérések mikroszkópiás képeken

Ellenőrző kérdések

Ellenőrző kérdések 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Hogy történik a leképezés az optikai mikroszkópban? Milyen lehetőségek vannak a kontraszt létrehozására? Mi korlátozza a felbontóképességet? Milyen paraméterek jellemzik az tárgylencsét? Milyen leképezési hibák léphetnek fel? Hogy befolyásolja a megvilágítás a felbontóképességet és a kontrasztot? Milyen célból alakalmaznak fluoreszcens jelölő anyagokat? Hogy lehetett elérni az Abbe-határt az optikai mikroszkópiában? Mi a holográfia alapelve? Hogy lehet atomi feloldást elérni optikai eszközökkel?

Segédanyagok

Kiegészítő olvasmányok • A guide to super-resolution fluorescence microscopy – http: //jcb. rupress. org/content/190/2/165. full

Programok • GWYDDION SPM kép megjelenítő és manipuláló program – http: //gwyddion. net/

Nagyfeloldású Mikroszkópia Dr. Szabó István KÖSZÖNÖM A FIGYELMET ! TÁMOP-4. 1. 1. C-12/1/KONV-2012 -0005 projekt „Ágazati felkészítés a hazai ELI projekttel összefüggő képzési és K+F feladatokra"