Mykobakteriolgia v 21 storo Juraj Trenkler Helena Zajacov

Mykobakteriológia v 21. storočí Juraj Trenkler, Helena Zajacová ŠN sv. Svorada Zobor, Nitra Národné referenčné centrum pre mykobaktérie

Robert Koch 24. marec 1882

Klasické metódy Mikroskopia – rýchla ale nešpecifická Kultivácia – vaječné, agarové a tekuté pôdy rast za 21 -63 dní Identifikácia - biochemická z narasteného kmeňa screening do 24 hodín identifikácia týždne až mesiace Citlivosť - na pôdach 21 -40 dní

Mikroskopia Marec 1882 -Koch farbil mykobaktérie zmesou anilínových farbív v alkalickom prostredí. Procedúra trvala 20 -24 hodín. Máj 1882 - Ehrlich - zlepšená metódu, ktorá bola tiež založená na alkalickom roztoku. August 1882 - Ziehl popísal novú metódu farbenia, v ktorej použil namiesto alkalického, kyslé prostredie, v r. 1892 Neelsen popísal metódu, ktorú používame dodnes 1962 - Truant, Brett a Thomas- fluorescenčné farbenie

Mikroskopia

Kultivácia Koch – morča, králik, koagulované sérum 1931 - Löwenstein, 1932 Jensen 1947 - Dubos a Middlebrook (1947) pôda 7 H 9 1977 - Middlebrook, Reggiardo, Tigertt-7 H 12 BACTEC 460 TB 1980 – MGIT – použítá neskôr v BACTEC 960

Mycobacteria Growth Indicator Tube MGIT

Testy citlivosti CANETTI G, et alt. : MYCOBACTERIA: LABORATORY METHODS FOR TESTING DRUG SENSITIVITY AND RESISTANCE. Bull World Health Organ. 1963; 29: 565 -78. Proporčná metóda na LJ pôde alebo agarových pôdach – 21 -28 dní Rýchlejšie metódy na metabolických pôdach – 7 -13 dní Mikroskopická metóda v tekutej pôde – 7 dní

Genetické metódy - predpoklady 1953 – Wilkins, Watson, Crick – objav štruktúry DNA – Nobelova cena 1962 1968 – Khorana, Holley, Nirenberg – Nobelova cena za popis translacie NK do bielkovín 1975 – Sanger sekvenovanie DNA – Nobelova cena 1980 1983 – Kary Mullis – vynález PCR – Nobelova cena 1993 1998 – Popis sekvencie DNA M. tuberculosis H 37 Rv

Použitie genetických metód v mykobakteriológii Dlhý generačný čas mykobaktérií 1. Dôkaz mykobaktérií vo vzorke 2. Identifikácia 3. Epidemiologická analýza 4. Hľadanie markerov rezistencie

Dôkaz mykobaktérií vo vzorke Accuprobe COBAS Amplicor Roche INNO-Lipa Mycobacteria HAIN Genotype „Home made“ PCR – IS 6110, HSP 65. . . . problémom je senzitivita a inhibícia prednosťou je rýchlosť a špecificita dokazuje iba DNA

Identifikácia Dôkaz špecifickej DNA pre daný druh Komplex M. tuberculosis – PCR na IS 6110 potvrdí príslušnosť ku komplexu MTBC Netuberkulózne mykobaktérie- analýza génomu ako 16 sr. DNA, HSP 65 sondami, metódou PRA alebo sekvenovaním

Hľadanie markerov rezistencie U niektorých AT poznáme presne alebo čiastočne miesta na DNA, kde mutácia znamená rezistenciu Ide hlavne o RIF a INH Možnosť stanovenia rezistencie aj priamo z materiálu pri mikroskopickej pozitivite Stanovenie citlivosti na RIF čo najskôr je najdôležitejšia informácia pre liečbu

Polymerázová reťazcová reakcia

Hybridizácia

Sekvenovanie DNA

Evolúcia M. tuberculosis

Mykobaktérie I.

Mykobaktérie II.

Mykobaktérie III.

Epidemiologická analýza M. tuberculosis Sledovanie šírenia konkrétneho kmeňa v populácii Analýza opakovaných ochorení – nová infekcia, relaps Odhaľovanie laboratórnych chýb Tri najčastejšie metódy: RFLP – Analýza fragmentov po pôsobení restrikčných endonukleáz MIRU – Analýza vnorených sekvencií Spoligotyping – Analýza opakujúcich sa sekvencií

Epidemické markery M. tuberculosis

Genetické metódy v ŠN sv. Svorada-Zobor Dôkaz M. tuberculosis – COBAS Amplicor Identifikácia v rámci komplexu MTBC – genetické sondy a „home made“ PCR na RD Identifikácia mykobaktérií – genetické sondy a metóda PRA Markery rezistencie – genetické sondy (RIF, INH) a „home made“ PCR Epidemiológia M. tuberculosis – odskúšané MIRU – v prípade financovania je možné začať okamžite robiť