Mycobactries DCEM 1 122009 L Brasme Laboratoire de

Mycobactéries DCEM 1 - 12/2009 L. Brasme Laboratoire de Bactériologie-Virologie-Hygiène CHU REIMS 1

Objectifs pédagogiques 2

Décès par maladies infectieuses dans le monde en 1998 3

Cas déclarés de tuberculose maladie en France par Région, 2005 (Nombre de cas et taux) Source: In. VS, déclaration obligatoire de tuberculose 4

Programme de lutte contre la tuberculose en France 2007 – 2009 : 6 axes 1. Assurer un diagnostic précoce et un traitement adapté pour tous les cas de TM 2. Améliorer le dépistage de la TM et des ITL et les enquêtes autour d'un cas 3. Optimiser l'approche vaccinale 4. Maintenir la résistance à un faible niveau 5. Améliorer la surveillance épidémiologique et les connaissances sur les déterminants de la TB 6. Améliorer le pilotage de la lutte antituberculeuse 5

Microbiologie Dr L. Brasme Bactériologie CHU Reims déc. 2009

Taxonomie • • • Ordre : Actinomycetales Famille : Mycobacteriaceae Genre : Mycobacterium « Complexe tuberculosis » Mycobactéries atypiques M. leprae 7

3 groupes selon pathogénie • « complexe tuberculosis » – M. tuberculosis – M. bovis – BCG – M. africanum – M. microti – M. canetii • Mycobactéries « atypiques » • Mycobacterium leprae (bacille de Hansen) 8

Habitat « Complexe tuberculosis » Animaux Mycobactéries atypiques Hydro-tellurique Mycobacterium leprae Homme 9

Pathogènes spécifiques M. tuberculosis Tuberculose M. leprae Lèpre M. ulcerans Ulcère de Buruli M. marinum Granulome des “aquariophiles” 10

Classification des mycobactéries non tuberculeuses GROUPE I M. kansasii M. marinum M. asiaticum M. simiae GROUPE III GROUPE IV M. gordonae MAC M. xenopi M. chelonae M. abscessus M. ulcerans M. terrae M. malmoense M. genavense M. hemophilum M. fortuitum M. peregrinum M. scrofulaceum M. szulgai M. flavescens Dr L. Brasme Bactériologie CHU Reims déc. 2009

Transmission (M. tuberculosis) • Interhumaine : Tuberculose bacillifère : > 5000 bacilles/ml • Aérienne, suspension prolongée + dispersion – Particules fines : 0, 5 – 3 µm – Inhalation – Pénétration bronchioles puis alvéoles 12

Précautions respiratoires ; 3 types de circonstances 1. suspicion diagnostique de tuberculose active contagieuse jusqu'à ce que celle-ci soit éliminée (c'est à ce stade avant traitement que le risque de transmission est maximum) ; 2. en cas de tuberculose active contagieuse, c'est-à-dire lorsque les prélèvements respiratoires directs sont positifs pour le bacille tuberculeux (B. A. A. R. présents dans les crachats ou les tubages) et jusqu'à la négativation de ceux-ci sur 3 prélèvements successifs, en moyenne 2 à 3 semaines après la mise en route d'un traitement efficace pour une souche sensible ; 3. lors de certaines procédures à risque de déclencher la toux et des mouvements expiratoires favorisant l'excrétion aérienne de bacilles tuberculeux : aérosols (en particulier pentamidine, qui sont formellement interdits en cas de tuberculose active) et expectoration induite. 13

Précautions respiratoires simples 1. chambre seule, porte fermée ; 2. déplacements du patient hors de sa chambre limités et obligation du port du masque ; 3. toute personne qui entre dans la chambre porte un masque ; 4. l'aération de la chambre doit être suffisante, avec un minimum de 6 renouvellements horaires pour les hôpitaux climatisés. Dans ce cas, l'air ventilé est évacué vers l'extérieur après filtration, sans recirculation dans les parties communes de l'établissement. Dans les hôpitaux non climatisés, l'aération sera obtenue par l'ouverture fréquente de la fenêtre, porte fermée. 14

Masques de protection respiratoire performances (norme EN 149 : 2001) Essais effectués avec un aérosol de 0, 6 µm de diamètre médian (particules de 0, 1 à 1 µm) 15

Mise en évidence des mycobactéries • Préparation de l’échantillon • Examen microscopique • Mise en culture • PCR 16

Mise en évidence des mycobactéries Prélèvement Fluidification – Décontamination - Neutralisation Centrifugation Culot Frottis Coloration Culture Amplification génique 17

Prélèvements pulmonaires ECBC - Crachats • Spontanément après effort de toux • Le matin au réveil • Flacons à large embouchure pour éviter la contamination • 3 jours de suite (présence discontinue) • Nébulisation de sérum salé possible (3 - 5 m. L) 18

Prélèvements pulmonaires Tubage gastrique • Prélever les sécrétions gastriques dégluties pendant la nuit • Patient alité depuis la veille • Le plus tôt après le levé 19

Prélèvements pulmonaires Prélèvements sous fibroscopie • Aspiration bronchique – Sécrétions bronchiques – Dilution dans eau stérile • Brossage bronchique Brosse déposée dans 1 m. L d’eau stérile • LBA Attention aux aérosols très contagieux produits lors du recueil 20

Prélèvements extra-pulmonaires urines • Vérifier : – Leucocyturie – Absence de bactériurie à germes banals • • Urines totales du matin Restriction hydrique la veille souhaitée 3 jours de suite Centrifugation des urines 21

Prélèvements extra-pulmonaires autres • Abcès - lésions cutanées • Liquides d’épanchement • Sang et moëlle osseuse • Selles – Déconseillé = flore commensale +++ – VIH pour portage de MAC pour prophylaxie – Biopsie colique préférée 22

Examen microscopique acido-alcoolo-résistance • Propriété tinctoriale • Richesse en lipides de leur paroi • Acides mycoliques liés au peptidoglycane 23

Examen microscopique coloration • Frottis à partir du culot ou du prélèvement • Fixation à la chaleur ou à l’alcool méthylique • Coloration à l’auramine – – – Microscope à fluorescence BAAR jaunes sur fond rouge Objectif 100 x à immersion (x 1000) • Si doute coloration de Ziehl-Nielsen (référence) – – – Microscope optique BAAR roses Objectif 25 x (x 250) 24

Coloration de Ziehl-Nielsen Coloration à l’auramine 25

Examen microscopique Expression des résultats • ED positif – ne permet la différenciation des mycobactéries – ne présume pas du caractère viable des bacilles • ED négatif ne signifie pas l’absence de mycobactéries • « Limite de détection » : 26

Culture 42 jours à 37°C 27

Antibiogramme • Réalisation : – en milieu liquide sur tube MGIT – en milieu solide (méthode des proportions) • Molécules testées : – – – Streptomycine Isoniazide Rifampicine Éthambutol Pyrazinamide • Résultat en 8 à 10 jours 28

Traitement de la tuberculose pulmonaire • Objectifs : – Action sur bacilles intra et extra cellulaires – Éviter la sélection de mutants résistants – Nécessité d’une bonne observance • Recommandations : – Phase initiale de 2 mois – Phase de continuation de 4, 7 voire 10 mois Dr L. Brasme Bactériologie CHU Reims déc. 2009

Place de la PCR Sensibilité aux antibiotiques PCR Identification d’espèce Épidémiologie par génotypage 30

PCR diagnostique caractéristiques • Moins sensible que la culture • Technique reproductible si 20 -40 CFU/ml Efficacité de la PCR Examen microcopique positif Se 100% Examen microcopique négatif Se 50% 31

Indications de la PCR Jamais en systématique • Si frottis positifs permet d’orienter vers complexe tuberculosis • Chez l’immunodéprimé si présence de lésions pour éliminer une tuberculose • Si frottis négatif avec clinique évocatrice car VPP proche de la culture 32

Programme de lutte contre la tuberculose en France 2007 - 2009 • Axe 2 : « améliorer le dépistage de la tuberculose maladie et infections tuberculeuses latentes (ITL) relevant d’un traitement » test de dépistage des ITL = IDR tuberculine place actuelle des tests basés sur la détection d’interféron-γ ? 33

Actualités diagnostiques • Nouveau test indirect = détection de la production in vitro d’IFN- à partir de sang mis en présence d’antigènes spécifiques de M. tuberculosis 2 tests disponibles : – Quanti. FERON-TB – T-SPOT. TB 34

IDR à la tuberculine quelle place dans le diagnostic ? • Diagnostic tuberculose maladie Appoint très secondaire si culture négative • Diagnostic tuberculose infection Intéressant en association à la clinique • Limites : – Reproductibilité opérateur dépendante – Lecture optimale à 48 -72 heures 35

Interprétation du test cutané tuberculinique • Mesure de la réaction après 48 à 72 heures • Mesure de l’induration, pas de l’érythème • Noter la réaction en millimètres, pas “négative” ou “positive” • Nécessité d’un personnel entraîné 36

Production d’IFN- par les LT lors de la présentation d’Ag par les CPA Lancet Infect Dis. 2004 Dec; 4(12): 761 -76. 37

Principe du dosage de l’IFN • Utilisation de 3 Ag spécifiques du « complexe tuberculosis » – – – ESAT-6 : Early Secreted Antigenic Target (6 k. D) CFP 10 : Culture Filtration Protein 10 TB 7. 7 • Codés par la région de différenciation délétée RD 1 • Détection en 18 -24 H de la production in vitro d’IFN- à partir de sang mis en présence des Ag 38

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Performances globales des tests sanguins / IDR *Menzies, Annals of Internal Medicine, 2007 40

Recommandations HAS, 12/2006 1. Enquête autour d’un cas, uniquement chez les adultes (de plus de 15 ans) ; 2. Professionnels de santé lors de leur embauche, et pour ceux travaillant dans un service à risque, c’est-à-dire dans les mêmes conditions que celles préconisées par les recommandations sur l’IDR (cf articles R. 3112 -1 et R. 3112 -2 du Code de la santé publique) ; 3. Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de la tuberculose-maladie souvent difficiles à étiqueter ; 4. Avant mise en route d’un traitement par anti-TNFα dans les mêmes conditions que les Recommandations de l’AFSSa. PS (Prévention et prise en charge des tuberculoses survenant sous anti. TNF, 2005). 41

Indications non retenues par la HAS • Suivi d’une tuberculose infection latente traitée ou non • Suivi du traitement d’une tuberculose-maladie • Patients infectés par le VIH • Dépistage de tuberculose-infection latente chez sujet en provenance de pays à prévalence élevée de tuberculose • Enfant études complémentaires 42

Questions nécessitant des études complémentaires • Corrélation entre les 2 techniques ? • Spécificité : – vs M. bovis et BCG : OK – vs M. marinum et M. kansasii ? • Impact d’une IDR préalable ? • Résultats quantitatifs et corrélation avec degré d’exposition au risque 43

L’axe 3 du programme en juin 2007 optimiser l'approche vaccinale • Vacciner durant le premier mois de vie les nouveau-nés à risque • Former à l'utilisation et la technique du BCG intradermique • Suivre la couverture vaccinale des enfants à risque 44

BCG - Juillet 2007 • Annonce de la suspension de l’obligation vaccinale en même temps que celle du programme tuberculose. • Décret du 17 juillet 2007 • Recommandation de vaccination selon avis du CSHPF/CTV du 9 mars 2007 • Circulaire du 14 août 2007 45

L’avis du CSHPF Le BCG est recommandé chez tout enfant : • • né dans un pays de forte endémie tuberculeuse dont au moins l'un des parents est originaire de l’un de ces pays ; devant séjourner au moins un mois d’affilée dans l’un de ces pays ; ayant des antécédents familiaux de tuberculose (collatéraux ou ascendants directs) ; • résidant en Île-de-France ou en Guyane ; • dans toute situation jugée par le médecin à risque d'exposition au bacille tuberculeux notamment enfants vivant dans des conditions de logement défavorables (habitat précaire ou surpeuplé) ou socio-économiques défavorables ou précaires (en particulier parmi les bénéficiaires de la CMU, CMUc, AME, …) ou en contact régulier avec des adultes originaires d’un pays de forte endémie. 46

Obligation BCG chez les professionnels de santé • Maintenue • Constitution en cours d’un groupe de travail dans le cadre du CTV sur l ’opportunité du maintien de cette obligation 47

Axe 4. Maintenir la résistance à un faible niveau 48

Tuberculose MDR et XDR : définitions • Antituberculeux majeurs = INH et rifampicine MDR : résistance à INH et rifampicine • Antituberculeux de 2ème ligne : – Aminosides – Fluoroquinolones – Ethionamide – Pyrazinamide XDR : MDR et résistance à 1 aminoside (kanamycine, amikacine ou capréomycine) et résistance aux fluoroquinolones 49

La multirésistance est-elle un réel problème ? • Taux stable mais réelle menace Surveillance de la multirésistance (source CNR). Réseau de plus de 300 laboratoires de microbiologie assurant la culture des mycobactéries 50

XDR en France • Etude CNR 1992 à 2006 • 14 souches en 15 ans • 3 % des MDR pour lesquelles existent des données de sensibilité aux aminosides et FQ (439 souches sur un total de 743) • 4 % en 2006 (2 souches sur 53 MDR) 51