MYCOBACTERIA Mycobacteria Bacilli 2 4 m forme filamentose

MYCOBACTERIA

Mycobacteria • Bacilli (2 -4 µm), forme filamentose (molto sottili fino a 10 -15 µm) • Immobili • Asporigeni • Sprovvisti di capsula • Aerobi obbligati • Alcool-acido resistenti

Classificazione

Struttura cellulare • Parete cellulare molto spessa • Componenti della parete: peptidoglicano, diaminopimelato, polisaccaridi (glucano, mannano, arabino-galattano, arabino-mannano) • Inclusi citoplasmatici (lipidi, glicogeno, polimetafosfati)

Parete cellulare • Composizione: – Grosse quantità di glicolipidi: • acido micolico (60%) • complessi lipidiarabinogalattani • lipoarabinomannani – Scarso petidoglicano

Gran parte delle proprietà esclusive che caratterizzano il genere Mycobacterium sono, direttamente o indirettamente, legate alla struttura della parete cellulare

Mycobacterium spp. Parete cellulare • Funzioni: – Forma e prevenzione lisi osmotica (peptidoglicano) – Inibizione ingresso composti chimici • Crescita lenta • Maggiore resistenza agli agenti chimici • Maggiore resistenza alla fagocitosi – Induzione sintesi citochine (TNF- ) da parte dell’acido micolico

I LIPIDI DELLA PARETE BATTERICA - GRASSI SOLUBILI IN ACETONE - CERE - FOSFATIDI

CERE • Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i quali gli acidi micolici) ed alcoli. La cera D, che in realtà è un glicopeptidolipide, è soprattutto nota per le sue proprietà adiuvanti; essa infatti, se inoculata in emulsione idro-oleosa associata ad un antigene proteico, potenzia enormemente la risposta immune umorale e cellulare del soggetto ricevente verso l’antigene suddetto.

ACIDI MICOLICI • Gli ACIDI MICOLICI sono quelli che più di frequente si trovano esterificati nelle molecole lipidiche, si tratta di acidi grassi β-idrossilati caratterizzati da una lunga catena satura di atomi di C (da 83 a 93) A livello della superficie esterna del cell wall gli acidi micolici svolgono la funzione di recettori fagici.

FATTORE CORDALE Un micoside oggetto di studi approfonditi è il DIMICOLILTREALOSO meglio noto col nome di FATTORE CORDALE, così chiamato perché i micobatteri tubercolari, privati di tale sostanza, perdono la caratteristica di svilupparsi, su certi terreni di coltura, in fasci serpentiformi.

FOSFATIDI • Consistono di glicerolo esterificato con acidi grassi (palmitico, oleico) e con acido fosforico Sono capaci di evocare da soli una reazione cellulare granulomatosa caratteristica e sovrapponibile a quella che si osserva nell’infezione tubercolare

CARATTERISTICHE ANTIGENI Natura Polisaccaridica (parete cellulare) Arabinogalattani Immunogeni solo se inoculati insieme alle cellule Natura proteica (citoplasmatici) Responsabili della sensibilizzazione di tipo allergico

Mycobacterium tuberculosis

MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA Ø La tubercolosi è un’affezione polmonare e pertanto diffonde per via aerea da uomo attraverso i nuclei essiccati delle goccioline di saliva emessi con la tosse dei malati di tubercolosi Ø La prima infezione si traduce in un’infiammazione localizzata a carattere essudativo di un limitato distretto del parenchima polmonare con compromissione dei linfonodi mediastinici (COMPLESSO PRIMARIO)

Mycobacterium tuberculosis in lung

MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA Ø Al complesso primario segue uno STATO ALLERGICO evidenziabile mediante iniezione di TUBERCOLINA che generalmente dura tutta la vita Ø In seguito ad una reinfezione o riattivazione del complesso primario, l’infezione può compromettere il parenchima polmonare e diffondere a qualsiasi organo

DIAGNOSI DI LABORATORIO • ESAME MICROSCOPICO • ESAME COLTURALE • IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA • TIPIZZAZIONE FAGICA • ANTIBIOGRAMMA

ESAME MICROSCOPICO FLUORESCENZA COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen

FLUORESCENZA 400 x

ESAME MICROSCOPICO COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen L’esame microscopio assume, per la ricerca dei micobatteri, una rilevanza diagnostica che non trova riscontro in altri settori della batteriologia, e ciò grazie alla peculiare proprietà di tali microorganismi di essere alcoolacido resistenti. La natura della alcool-acido resistenza non è ancora del tutto chiarita, essa sembra comunque correlata alla componente lipidica della parete cellulare: gli acidi micolici si complesserebbero infatti con la fucsina impedendone il rilascio nonostante il trattamento con alcool ed acido

Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (1 di 2) Step 1: • Versare la fucsina basica Step 2: • Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min • Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (2 di 2) Step 3: • Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min) • Lavare con acqua Step 4: • Contrastare con blu di metilene per 1 -2 min • Lavare con acqua

Colorazione di Ziehl-Neelsen Osservazione microscopica • Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso • Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

Ziehl-Neelsen 1000 x

ESAME COLTURALE • L’esame colturale per micobatteri presenta delle peculiarità, estranee alla batteriologia comune, legate alla lentezza con cui tali germi crescono sui terreni di coltura. • Il divario di ritmo moltiplicativo esistente fra i micobatteri e l’eventuale flora associata è infatti tale che la presenza di quest’ultima, sia pur costituita da specie non particolarmente invasive ed a carica microbica ridotta, finisce regolarmente con lo sfruttare completamente tutta la superficie di terreno a disposizione ben prima che le colonie dei micobatteri, ivi comprese anche le specie a crescita più rapida, possano raggiungere dimensioni tali da poter essere apprezzate. • La coltivazione dei micobatteri è possibile solo a condizione che questi si trovino in coltura pura (eventualità limitata in pratica solo a materiali particolari quali liquor, liquidi cavitari, sangue) o che a tale condizione possano essere ricondotti artificialmente (decontaminazione).

LA DECONTAMINAZIONE Il decontaminante ideale è una sostanza dotata di attività antibatterica su tutta la flora associata e del tutto priva di attività nei confronti dei micobatteri. a) Na. OH al 4%. Può essere considerato il capostipite dei procedimenti di decontaminazione (svolge anche azione fluidificante); ormai non più usato a causa dell’elevata lesività sui micobatteri. b) H 2 SO 4 al 4%. E’ eccessivamente lesivo per i micobatteri. c) Acido ossalico al 5%. Il suo impiego è giustificato solo per materiali fortemente contaminati da Pseudomonas aeruginosa essendo assai lesivo per i micobatteri. d) Fosfato trisodico al 25% + cloruro di benzalconio allo 0, 3%. Decontamina e fluidifica al tempo stesso, la lesività sui micobatteri è ridotta e le contaminazioni risultano contenute. f) Fosfato trisodico allo 0, 03% + Na. OH allo 0, 05% + di isobutil-naftalina-sulfonato allo 0, 03%. L’attività decontaminante è molto buona, media la lesività sui micobatteri.

CARATTERISTICHE COLTURALI • velocità di crescita • aspetto delle colonie – – rugose lisce fotocromogene scotocromogene non pigmentate • crescita a varie temperature • test di inibizione selettiva

TERRENI SELETTIVI Terreni Componenti Sostanze inibitrici Lowenstein-Jensen Uova coagulate, Sali, glicerolo, fecola di patate Verde malachite, cicloesimide, lincomicina, acido nalidixico Middlebrook 7 H 10 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina, catalasi, glicerolo Terreno 7 H 11 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina, catalasi, glicerolo, idrolizzato di caseina Verde malachite, cicloesimide, lincomicina, acido nalidixico Carbenicillina, amfotericina B, polimixina B

Caratteristiche colturali

Caratteristiche delle colonie osservate con un microscopio da dissezione

METODI COLTURALI “ALTERNATIVI” • metodo radiometrico • terreno bifasico • terreno con indicatore fluorescente • terreno Redox

METODO RADIOMETRICO • flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14 C • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • liberazione di CO 2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico • rilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

METODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERI

TERRENO BIFASICO • flacone di terreno liquido per micobatteri • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato) • arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate moderato sul terreno solido accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE • provetta di terreno liquido per micobatteri • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno • comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico • rilevamento della fluorescenza – visivo, sotto una lampada UV – automatizzato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

TERRENO REDOX • i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme • i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazano dai micobatteri in crescita • il formazano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA • accumulo di niacina • riduzione dei nitrati • catalasi – quantitativa – termoresistente • • idrolisi del Tween 80 ureasi arilsolfatasi riduzione del tellurito

ANTIBIOGRAMMA • i farmaci antitubercolari maggiori • il principio del metodo delle proporzioni • l’antibiogramma manuale • l’antibiogramma automatizzato • l’antibiogramma sui micobatteri non tubercolari

ANTIBIOGRAMMA L’Antibiogramma dei Micobatteri viene eseguito in capsule di Petri a quadranti contenenti agar 7 H 11 ü Un quadrante è usato come controllo, mentre ciascuno degli altri quadranti contiene un farmaco antimicrobico diverso ü Tutti i quadranti vengono inoculati con una concentrazione standardizzata del microrganismo in esame ü La sensibilità a ciascun farmaco è determinata paragonando il numero delle colonie cresciute nei quadranti contenenti i farmaci con il controllo (se la percentuale di resistenza è superiore all’ 1% il ceppo viene considerato resistente al farmaco)

ANTIBIOGRAMMA Antibiotico incorporato nell’agar Antibiotico incorporato in dischetti di carta

La diagnostica tradizionale • Esame microscopico – test rapido ma scarsamente sensibile • Esame colturale – sensibile ma richiede da una a otto settimane; problema delle contaminazioni • Identificazione – test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi • Antibiogramma – diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni – da ceppo isolato: tempi lunghi

Metodi di identificazione “alternativi” • DNA probe • HPLC degli acidi micolici • sequenziamento genico 16 S r. DNA – SOD – HSP 65 –

DNA-probe, alternativa all’identificazione? • Vantaggi – enorme risparmio di tempo – specificità pressoché assoluta • Svantaggi – disponibili per un numero limitato di specie – costo – complessità di esecuzione?

IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE DNA-probes marcate con 125 I

HPLC degli acidi micolici • acidi grassi, ramificati in posizione • presenti nella parete batterica dei generi: – – – Corynebacterium: 22 -38 atomi di C Rhodococcus: 34 -52 atomi di C Nocardia: 44 -60 atomi di C Gordona: 48 -66 atomi di C Tsukamurella: 64 -78 atomi di C Mycobacterium: 60 -90 atomi di C • presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici – alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-

HPLC degli acidi micolici • saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri • frazionamento mediante HPLC • individuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento

profilo HPLC del M. tuberculosis complex ad eccezione del M. bovis BCG SI

esempi di profili HPLC SI SI

Il sequenziamento genico • E’ la tecnica di riferimento per l’identificazione • Possibili bersagli – – r. RNA o r. RNA 16 S gene codificante per le heat shock proteins gene codificante per la superossido dismutasi spacer fra i geni codificanti per r. RNA 16 S e 23 S

Amplificazione genica alternativa all’esame microscopico? • Vantaggi – sensibilità superiore (ma non di molto) – specificità di specie (ed eventualmente anche di genere) • Svantaggi – esecuzione complessa – costo elevato

Amplificazione genica alternativa all’esame colturale? • Vantaggi – molto più rapida – se positiva rende superflua l’identificazione – eseguibile anche su campioni pesantemente contaminati • Svantaggi – – – – non altrettanto sensibile non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie false negatività dovute agli inibitori false positività dovute a contaminazioni costo elevato esecuzione complessa impossibilità di eseguire l’antibiogramma

Target dell’amplificazione del M. tuberculosis complex • Geni presenti in copia singola – gene codificante per l’antigene di 65 -k. D (HSP) • Brisson-Noel et al. Lancet 1989 – gene codificante per l’antigene di 126 -k. D (fusion protein) • Hermans et al. J. C. M. 1990 – gene codificante per lo r. RNA 16 S • Boddinghaus et al. J. C. M. 1990 – gene codificante per l’antigene di 38 -k. D (proteina b) • Miyazaki et al. J. C. M. 1993 • Sequenze ripetute – IS 6110 • Eisenach et al. J. I. D. 1990

Raccomandazioni sull’impiego del test di amplificazione • Non sostituisce esame microscopico e colturale • Da eseguirsi solo su campioni selezionati • L’attendibilità del test sui materiali non respiratori non è dimostrata • Non utilizzabile per il monitoraggio della terapia • INTERPRETAZIONE: – Amplificazione + / Microscopico + = probabile TBC – Amplificazione - / Microscopico + : ripetizione su altri 2 campioni, se il risultato viene confermato = infezione da MOTT o presenza di inibitori – Amplificazione + / Microscopico - : ripetizione su uno o 2 campioni, se il risultato viene confermato = probabile TBC

Conclusioni • AMPLIFICAZIONE? SI, ma …. – solo in centri qualificati – solo su campioni selezionati – non per il monitoraggio della terapia • La sensibilità dei sistemi commerciali deve essere aumentata (ovviamente non a scapito della specificità) • Le tecniche in house non sono adatte all’impiego in routine

Epidemiologia molecolare • Sorveglianza della tubercolosi e tracciamento di ceppi particolari (Beijing) • Riconoscimento delle infezioni miste • Distinzione di recidive e reinfezioni • Individuazione delle contaminazioni di laboratorio

Principali tecniche per l’epidemiologia molecolare • PFGE – frammentazione del genoma mediante enzimi di restrizione specifici per siti poco frequenti • PCR random – usa primer scelti in maniera casuale • RFLP – applicabile a specie di cui si conoscono insertion sequence

RFLP • BERSAGLIO: il transposone IS 1610, di cui possono essere mediamente presenti nel M. tuberculosis complex da 6 a 17 copie, variamente dislocate nel genoma • PRINCIPIO: un enzima di restrizione, specifico per un sito presente all’interno del IS 1610, spezzetta il genoma in un numero di frammenti non inferiore al numero di IS presenti. I frammenti presentano dimensioni diverse a seconda della posizione dei singoli IS nel genoma • RIVELAZIONE: mediante elettroforesi si ottengono pattern che differiscono per il numero e la posizione delle bande • La possibilità che ceppi diversi abbiano pattern uguali sono trascurabili, la stabilità dei pattern è elevata

RFLP fingerprinting