Multiplicao Viral Lab Vir ICBS UFRGS Multiplicao dos

Multiplicação Viral Lab. Vir – ICBS - UFRGS

Multiplicação dos vírus “Evento central de existência e perpetuação dos vírus na natureza” - Produzir progênie viável – �Consequências “Nenhuma” (maioria dos vírus) Doença (Hepatites virais) Morte do hospedeiro (Ebola)

Conceitos básicos • Infecção [infere: inserir, penetrar] - Em virologia: processo replicativo do agente como um todo, incluindo penetração e as etapas subsequentes da replicação. - Infecção produtiva: produtiva todas as etapas completas resultando na progênie viral. - Infecção abortiva: abortiva após a penetração , o ciclo replicativo for interrompido em alguma etapa. - Susceptibilidade: Susceptibilidade capacidade das células de serem infectadas naturalmente pelo vírus. - Permissividade: Permissividade condições intracelulares para a ocorrência da multiplicação viral.

• Espécies animais [também cultivos celulares] apresentam uma ampla variação de susceptibilidade a diferentes vírus. Hospedeiro Conjunto de espécies que podem ser infectadas naturalmente por um determinado vírus. • Tropismo: Tropismo predileção do vírus por determinadas células, tecidos ou órgãos do hospedeiro para multiplicar.

Etapas da Replicação 1 - ADSORÇÃO 2 - PENETRAÇÃO 3 - DESNUDAMENTO 4 – TRANSCRIÇÃO DOS GENES VIRAIS 5 – TRADUÇÃO DOS m. RNA E PRODUÇÃO DAS PROTEÍNAS VIRAIS 6 – REPLICAÇÃO DO GENOMA 7 – MONTAGEM / MATURAÇÃO 8 – 9 - LIBERAÇÃO

ADSORÇÃO • Ligação específica das partículas víricas na superfície das células hospedeiras. VAPs Proteínas da superfície dos vírions Receptores celulares

ADSORÇÃO • Receptores celulares proteínas [glicoproteínas] ou carboidratos [presentes em glicoproteínas] • Receptores específicos • Rinovírus • Vírus da febre aftosa • Receptores alternativos [vantagens evolutivas] • Herpesvírus • Togavírus

ADSORÇÃO • Receptores são determinantes na patogenia das infecções • Interações químicas: • Eletrostática • Pontes de hidrogênio + -+ ++ - + 8

ADSORÇÃO • Em alguns casos a interação vírus e receptores não suficientes para permitir o início da infecção. • Co-receptores • Interação vírus com proteínas adicionais da membrana celular HIV Receptor CD 4 + Co-receptor: receptor de citocina CCR-5, CXCR-4

ADSORÇÃO

PENETRAÇÃO • Transposição da membrana plasmática. • Fusão na superfície celular: • Retrovírus, herpesvírus [fusão do envelope na membrana celular] • Penetração após endocitose: • Penetração de vários vírus envelopados [flavivírus, ortomixovírus] • Alguns sem envelope [Adenovírus, reovírus]

DESNUDAMENTO • Refere-se a uma série de eventos que ocorrem após a penetração. • Resultando na exposição parcial ou completa do genoma viral Vírus DNA Vírus RNA

DESNUDAMENTO • Após o desnudamento, exposição às enzimas e fatores de replicação: • Vírus DNA e RNA de cadeia negativa: • TRANSCRIÇÃO • RNA de cadeia positiva: • TRADUÇÃO

Movimentação intracelular • Transporte até o local onde ocorrerão a expressão genica e a replicação. • Forma passiva, no interior de vesículas endocíticas • Interação componentes do citoesqueleto • Ou proteínas transportadoras • Penetração nuclear • Vírions pequenos, podem ser transportados intactos [parvovírus 18 – 24 nm] • Vírions maiores, precisam ser previamente desintegrados ou deformados

Expressão gênica • O genoma viral codifica diferentes proteínas que desempenham três funções básicas: • Assegurar a replicação do genoma; • Subverter funções celulares em seu benefício; • Empacotar os genomas recém replicados em novas partículas víricas.

Replicação do genoma • Dependendo do tipo e organização genômica, os vírus podem utilizar diferentes estratégias de expressão e replicação. • Baltimore [1971]: classificação dos vírus em 6 grupos • Tipo de genoma; • Local e estratégia de replicação.

ds= double stranded (dupla fita) ss=single stranded (fita simples)

Maturação e egresso • Formação das unidades estruturais do capsídeo pela interação entre as respectivas proteínas; • Incorporação do genoma ao capsídeo pré-formado ou em formação; • Liberação da progênie viral da célula infectada • Morfogênese: montagem das partículas víricas. • A capacidade infectiva = maturação

Maturação • Maturação intracelular Liberados por lise celular

Maturação • Maturação por brotamento em membranas celulares

Liberação da célula Liberação por lise da célula (com ou sem efeito citopático) Brotamento (com ou sem morte celular)

Resumo: Adsorção – Penetração Desnudamento Transcrição Tradução. Funções do REPLICAÇÃO CICLO DE MULTIPLICAÇÃO VIRAL hospedeiro (+ou-) Montagem (Maturação) Liberação 23 MULTIPLICAÇÃO

CULTURA DE CÉLULAS § Cultura de células é o processo pelo qual células são mantidas vivas e em multiplicação fora de seu tecido original, em condições controladas.

Cultivos celulares - cultivos primários (células diplóides) - linhas celulares (diplóide, 40 passagens ) - células de linhagem (número de passagens indefinido)

CULTIVO DE CÉLULAS Cultivo Primário - Preparadas diretamente das células obtidas de um tecido de um organismo - Sensível a vírus - Resiste poucas passagens ( máximo 20)

CULTURA DE CÉLULAS Células de linhagem § Capacidade ilimitada de crescimento em cultura – Derivadas de células tumorais – Sofreram transformação espontânea ou induzida Cultivo primário senescente Algumas células sobrevivem Seguem multiplicando-se Tornam-se “imortais”

CULTIVO DE VÍRUS IN VITRO - Garrafas de Vidro - Garrafas de Plástico - Garrafas fechadas ou abertas (CO 2) -Garrafas estacionárias ou rolantes -Tubos de vidro ou plástico -Tubos com lamínulas (tubos de Leighton) - Placas de microtécnica com 6, 12, 24, 96 orifícios

Tubos de cultivos celulares em equipamento rotativo Microplacas de cultivos celulares

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): É o dano que o vírus causa à célula ! - infelizmente, nem todos os vírus causam danos às células! - a maioria não causa dano nenhum!

Rotavírus BVDV FCV RSV

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: violeta de genciana)

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: carbazol)

Microscopia eletrônica