MTOKONDRYAL GENOM PROF DR HLYA YILMAZ AYDOAN Mitokondri

MİTOKONDRİYAL GENOM PROF. DR. HÜLYA YILMAZ AYDOĞAN

Mitokondri • Mitokondri: Hücrenin güç evi • Bu membranla sarılı organeller eritrositler ve terminal keratinositler haricinde bütün ökaryotik hücrelerde bulunurlar ve ATP üretiminden sorumludurlar. • ATP üretimi için çok sayıda enzime gereksinim duyulur. Bu enzimlerin çoğu sitozol kaynaklı olup mitokondriye bir çok kademeden geçerek kompleks bir mekanizma ile girerler. • Mitokondri – hücrede bol miktarda enerji harcayan hücrelerde • iskelet ve kalp kası hücrelerinde, • yüksek miktarda sekretuvar proteinin sentezlendiği ekzokrin pankreasta ve • sperm gibi hareketli hücrelerde fazladır.

• Mitokondri ; Yunanca, mitos = iplik; chondros = tane, buğday anlamına gelmektedir. • Oksijenli solunum yapan tüm hücrelerde bulunur. – Boyları 0. 2 - 5 mikron arasında; – şekli, ovalden çubuğa kadar değişir. • Sayıları hücre başına birkaç taneden 2500'e (KC hücresinde) kadar çıkar. • Canlı hücrelerde, şeklinin ve büyüklüğünün değiştiği, diğer mitokondrilerle birleştiği ve hareket ettiği görülür. Genellikle 5 - 6 tanesi ucuca gelerek bir iplik şekli meydana getirirler. • Video mikroskopisi mitokondrilerin fleksibl ve mobil organeller olduğunu ve sürekli olarak hücrenin enerji tüketiminin yüksek olduğu yere doğru hareket ettiklerini göstermiştir.

Mitokondri Enerji Üretimi • • Beta-oksidasyon ile Asetil-Ko. A’ ların üretimi TCA döngüsü ile NADH gibi indirgen eşdeğerlerin üretimi İndirgenmiş flavoproteinlerin üretimi Elektron transportu ile NADH’ların yükseltgenmesi ve buna bağlı olarak ATP sentezi – Karbohidrat ve Yağ asitlerinin yıkılımından elde edilen enerjinin oksidatif fosforilasyon prosesi ile ATP’ye dönüşümü

• Mitokondri kendi DNA’sına sahiptir ancak kodlama kapasitesi sınırlıdır. • Bakteriye benzer şekilde aynı büyüklükte ribozomlara sahiptir. • Pek çok mitokondriyal enzim nüklear DNA tarafından kodlanır • Nüklear DNA tarafından kodlanan m. RNA translasyonu sitoplazmada gerçekleşir. • Translasyon sonrası oluşan pp. ler mitokondri içine girer.

• Bitki hücresi mt. DNA’sının büyüklüğü 200. 000 - 2. 500. 000 bp • Kloroplast (kp. DNA) da dairesel çift sarmal olarak bulunur, büyüklüğü 120. 000 -160. 000 bp

• Mt. DNA ve Kp. DNA’larının evrimsel kökeni tartışmalıdır. • Genel olarak kabul edilen görüşe göre; mitokondriler “çok eskiden konakçı hücrenin sitoplazmasına girmiş ve bu organellerin öncülü olmuş bakterilerin kromozomlarının kalıntılarıdır ”.

mt. DNA • Mitokondri proteinlerinin %95’inden fazlası nukleus DNA’sı tarafından kodlanır. • Tipik bir somatik hücrede – hücre DNA’sının %0. 1’den daha azı mitokondrilerde bulunmaktadır. • Ancak mitokondri sayısının daha fazla olduğu döllenmiş ve bölünen yumurta hücrelerinde mt. DNA oranı fazladır. • Mt. DNA molekülleri nukleustaki kromozomlardan çok daha küçüktür.

MİTOKONDRİAL GENOM’UN ÖZELLİKLERİ - 1 • İnsanlarda mt. DNA, – 16. 569 baz çiftinden oluşan, – kapalı dairesel, çift iplikli bir DNA molekülüdür. • 37 gen içerir. Bu genlerden 13 tanesi mitokondrial ETZ için polipeptidleri kodlar, • Ayrıca 22 t. RNA ve 2 r. RNA (12 S ve 16 S) genleri vardır. • Her bir organel, 2 - 12 mt. DNA molekülü içerir. • Nükleer DNA’dan bağımsız olarak kendi genomunun replikasyon, transkripsiyon ve translasyonunu gerçekleştirir !!!

MİTOKONDRİAL GENOM’UN ÖZELLİKLERİ - 2 § Histonlar yer almaz. § Onarım sistemi çok zayıftır. • Mutasyona duyarlılık • Serbest oksijen radikallerinin etkinliği § Antioksidan sistem yetersizdir.

MİTOKONDRİAL GENOM’UN ÖZELLİKLERİ - 3 § Maternel olarak kalıtılır. § Mitokondriyal hastalıkların prevalansı: 1/10. 000 yeni doğan • Mitokondriyal genetiği popülasyon genetiği ilkeleri yönetir. • Yeni bir mt. DNA mutasyonu olduğunda, hücreler başlangıçta normal ve mutant DNA dizilerini birlikte bulundurur – Heteroplazmi olarak bilinen bu durum aksi halde ölümcül ve hastalığa sebep olabilecek mutasyonların devamını sağlar. – Tamamıyla normal veya tamamen mutant mt. DNA’nın birlikte bulunmaları “homoplazmi” olarak adlandırılır. – Hücre bölünmesi esnasında replikatif dağılım (segregasyon) denen olayla mitokondriler yavru hücrelere eşit olacak biçimde paylaştırılır.

MİTOKONDRİAL GENOM’UN ÖZELLİKLERİ - 4 Genetik olarak, mitokondrial DNA değişiklikleri iki alt grupta toplanmaktadır: § Protein genlerini değiştiren mutasyonlar § Mitokondrial protein sentezini etkileyen mutasyonlar (mt. r. RNA veya mt. t. RNA değişiklikleri)

MİTOKONDRİAL GENOM’UN ÖZELLİKLERİ - 5 § mt. DNA gerek mitotik gerekse post-mitotik hücrelerde sürekli bir turnover’e sahiptir (Wallace ve ark. , 1995). mutasyon olasılığının artışı § Hücrelerin nükleer genlerden iki kopya içerirken, mitokondrial genlerden binlerce bulundurması, mutasyon olasılığını arttırmaktadır.

• Mitokondrial DNA’nın iki ipliği; ağır (H) ve hafif (L) iplik olarak adlandırılır. • Her iki iplik farklı yönde transkribe edilir, • replikasyon orijinleri farklıdır ve • farklı ürünleri kodlarlar.

Mitokondri bölünmesi • Mitokondrilerin çoğalması mevcut mitokondrilerin bölünmesi şeklinde olur. • Mt. DNA hücre bölünmesinden önce mitokondrinin her bölünüşünde kopyalanır. • Oluşan mitokondriler hücre bölünmesi esnasında yavru hücrelere gelişigüzel geçerler.

Mitokondriyal DNA maternal olarak kalıtılır • Mt. DNA genomunun küçüklüğü replikasyon hızını arttırır. • Her hücre çok sayıda mitokondri içerdiği için, hücre başına çok sayıda mt. DNA geni kopyası eksprese edilebilir (binlerceye kadar). • Normal ve mutant mt. DNA’lar aynı hücrede birarada bulunabilir. Bu durum heteroplazmi olarak adlandırılır. • Solunum zincirindeki genlerin (OXPHOS ) delesyonları (eğer yaşarsa) heteroplazmiktir. – Örn. Kearns-Sayre sendromu • Oysa missense mutasyonlar çoğunlukla homoplazmiktir. – Örn. Leber sendromu

Mt. DNA muhtemelen geliştiği bakteriyal DNA gibi yetersiz tamir edilir. Bu nedenle mutasyon oranı yüksektir Nüklear DNA’dakinden en az 10 kat fazla oranda Yaşlanma da hücre enerji üretiminin azalmasına yol açan mt. DNA mutasyonlarının akümülasyonuyla ilişkili olabilir.

Nüklear DNA’ya benzemeksizin mt. DNA cinsiyete sahip değildir. Bir sperm hücresi oositle karşılaştırıldığında memeli zigotunun Mt. DNA içeriğine sperm hücresinin katkısı sadece 1/10. 000’dir. Pratikte insan mt. DNA’sının oosit sitoplazması aracılığıyla maternal olarak kalıtıldığı kabul edilir.

Mitokondrial DNA’nın linner düzenlenişi Siyah renkli barlar t. RNA genlerinin yerini göstermektedir. ND: NADH dehidrogenaz, COX: sitokrom c oksidaz.

Mitokondriyal genomda şifre değişiklikleri • Genetik şifredeki bilinen çok nadir değişikliklerin çoğu sadece 10 -20 protein şifreleyen mt. DNA’da oluşur. • Mitokondrilerin kendi t. RNA’ları olduğundan bunların şifre değişiklikleri hücresel genomu etkilemez. • Mitokondrideki en sık değişiklikler ve hücresel genomlardaki tek kodon değişiklikleri sonlanma kodonlarını içerir.

Mitokondriyal genomda şifre değişiklikleri • Omurgalı mt. DNA’ları – 13 protein, – 2 r. RNA ve – 22 t. RNA’yı şifreleyen gene sahiptir. • Mitokondrilerde alışılmadık wobble kuralları – 22 t. RNA’nın olası 64 kodon üçlüsünün tümünün şifresini çözmesini sağlar. – Normal şifre için gerekli 32 t. RNA’ya gereksinilmez.

Mitokondriyal genomda şifre değişiklikleri • Normal şifrede sadece iki aa. - metiyonin ve triptofan- tek kodonla şifrelenir. • UGA en bariz gözlenen şifre değişikliğidir, sonlanma kodonu olarak görev yapmaz, triptofanı şifreler. • t. RNATrp sonlanma kodonu UGA veya normal Trp kodonu UGG’ye Trp kalıntısı yerleştirir. • AUA’nın Ile kodonundan Met kodonuna dönüştürülmesinin de benzer bir etkisi vardır. • Normalde Met kodonu AUG’dir ve tek t. RNA her iki kodonu da tanıyabilir. Bu en sık mitokondriyal şifre değişikliğidir.

Üçüncü baz dejenerasyonu Crick‘in Wobble Hipotezi – antikodonun ilk bazı (kodondaki 3. baza karşılık gelen) "wobble pozisyonu" olarak tanımlanır.

Wobble Hipotezi • Kodonun ilk iki bazı antikodonun 2. ve 3. bazlarıyla normal H-bağları yaparlar. • Kalan pozisyonda, daha az katı kurallar uygulanır ve normalde gözlenmeyen eşleşme oluşabilir. • Kurallar: Antikodonda – birinci baz U, – birinci baz G, – birinci baz I, – • Kodonda A veya G’yi tanıyabilir; U veya C’yi tanıyabilir; ve U, C veya A’yı tanıyabilir (I, A’nın deaminasyonuyla oluşur) Wobble Avantajı: m. RNA’dan t. RNA’nın disosiasyonu ve protein sentezi daha hızlı olur.

Mitokondrial Gen Transkripsiyonu • Transkripsiyonun başlangıç bölgesi, mt. DNA’nın Displacement loop (D-loop) denilen kontrol bölgesidir. • Ağır iplik transkripsiyonu saat yönünde, hafif iplik transkripsiyonu saat yönünün tersine ilerler. • Hafif iplikçik bir polisistron olarak transkribe edilirken, ağır iplikçik iki polisistron olarak transkribe edilir. • Üç tane bariz promotor sekans tanımlanmıştır: – • bir tanesi hafif iplik, ikisi ağır iplik içindir. Ağır ve hafif iplik promotorlarının her ikisi de başlangıç bölgelerinin yakınında spesifik nükleotid dizileri ve upstream regülatör bölgeler içerirler.

Mitokondrial Gen Transkripsiyonu • Transkripsiyon faktörlerinden iki tanesi iyi çalışılmıştır. • Bunlardan mitokondrial transkripsiyon faktörü A (mt. TFA) transkripsiyonun başlamasını stimüle eder, • Mitokondrial transkripsiyon sonlanma faktörü (mt. TERF) ise transkripsiyonun sonlanmasında gereklidir. • mt. TFA ve mt. TERF nükleer genlerce şifrelenir.

• Oksidatif fosforilasyonun (OXPHOS) komponentlerini şifreleyen genler, nükleer ve mitokondrial genomun her ikisinde de bulunur. Her ikisinin ifadesini birlikte kontrol eden bir mekanizma vardır. • Nükleer solunum faktörü 1 ve 2 (NRF 1 ve 2) ile genel transdüksiyon faktörü Sp 1, mt. TFA’nın expresyonunun yanı sıra, nükleer OXPHOS genlerinin birkaç tanesini aynı anda düzenler. • Nükleer transkripsiyon ve mitokondri fonksiyonlarını etkileyen reseptörler önerilmiştir. – D-Loop bölgesinde; • Glukokortikoid, Vitamin D, tiroid hormon ve retinoik asit cevap elementleri tanımlanmıştır. • Mitokondrial gen transkripsiyonu ve translasyonunun regüle edildiği açıktır.

Mitokondrial DNA Hasarı • Mitokondrial hastalıklar, maternal, mendelyen veya ikisinin bir kombinasyonu olarak kalıtılabilirler. • Aynı mitokondrial DNA mutasyonu oldukça farklı fenotipler ortaya çıkartabilir ve farklı mutasyonlar benzer fenotipler üretebilir. • Patojenik mt. DNA mutasyonları, baz değişimi ve yeniden düzenlenme mutasyonlarının her ikisini de içerir. • Yaşla birlikte mt. DNA mutasyonlarının arttığı bilinmektedir. Bu nedenle mitokondrial fonksiyon yaşla azalır. • mt. DNA’daki mutasyonlar ve oksidatif hasarın yüksek seviyede olması, – DNA’nın lokasyonunun, oksidantların oluştuğu iç mit. membran yanında olması ve – mt. DNA’da koruyucu histonlar ve DNA tamir aktivitesinin eksikliğidir.

Mitokondrial DNA polimeraz • Mitokondrial DNA polimeraz, – – DNA polimeraz 3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesine sahiptir nükleer kökenli bir enzimdir 250. 000 nükleotidde 1 nükleotidden daha az yanlış eşleşme yapar. • DNA sentezinin bu yüksek doğruluğuna rağmen, DNA polimeraz gama çerçeve kayması (frame shift) hatalarına sebep olur ve bu bölgeler potansiyel sıcak noktalar (hot spots) olarak önerilir.

• Bu hot-spotlardan en önemlisi D-loop bölgesidir. • İnsan kanserlerinde somatik mt. DNA mutasyonlarının bir çoğu D-loop bölgesinde ve bu bölge içinde de özellikle D-310 bölgesinde bulunur. • D-310 bölgesi insanlar arasında polimorfik uzunluk varyasyonu gösterir. • 8 -oxo-2’-deoksiguanozin miktarı, oksidatif DNA hasarının bir belirleyicisidir. • Memeli mitokondrisi 8 -oxo. G’yi, genomundan etkili bir şekilde uzaklaştırır fakat yaşın ilerlemesi ile 8 -oxo. G birikir. • 8 - oxo. G’yi genomdan uzaklaştıran enzim, 8 - oxoguanin DNA Glikozilaz (OGG 1 DNA Glikozilaz) enzimidir.

Oksidatif mt. DNA Hasarı • İnsan hücrelerinde OGG 1 transkriptinin alternatif kesilmesi, nükleus ve mitokondride izole olan, sırasıyla, a ve b formlarını oluşturur. • Mitokondride izole olan b formundaki enzimin, mitokondriye hedeflenmesinde işlev gören sekansdaki (MTS) bir mutasyonun böbrek kanseri ile ilişkili olduğu bulunmuştur. • Oksidanların, mt. DNA delesyonlarının oluşumundaki rolü, doxorubicin’in yarattığı etkilerin gözlenmesi ile de desteklenmiştir. • Doxorubicin, mitokondrial oksidan üretimini stimüle eden bir bileşiktir ve bu yolla mt. DNA delesyonlarını arttırdığı gösterilmiştir. • Mitokondride Mn-süperoksit dismutaz gibi, serbest oksijen radikallerini, daha az reaktif oksijen bileşiklerine dönüştürebilen bir enzim olmasına rağmen, bu reaksiyon tüm oksijen radikallerinin yakalanmasında tamamen etkili değildir.

Oksidatif mt. DNA Hasarı • Oksijen radikallerinin mt. DNA’ya atağı rastgeledir. Bazı besinler, antioksidan görevi görebilir ve serbest radikalleri baskılayabilir. • E vitamini, mitokondrial peroksit oluşumunu düzenler ve mitokondri içinde bir antioksidan görevi görür. • Cisplatinum gibi bazı kemoterapotik ajanlar da, mitokondride birikir ve DNA’ya hasar verir. • Bu yüzden tümör hücrelerinin mt. DNA’sında bulunan değişikliklerin bazıları bu terapotik ajanlar ile tedavinin sonucu olabilir.

MİTOKONDRİYAL DNA MUTASYONLARI • Mozaisizimden farklı olarak, heteroplazmi anneden çocuğa heteroplazmik yumurta ile nakledilebilir. • Hem mutasyonlar hem de heteroplazmi sıklıkla zaman içerisinde bireylerde görülebilir. • Aynı kişi hem delesyon hem de duplikasyonları taşıyabilir ve birbirlerine oranları zamanla değişebilir.

Mt. DNA ve Hastalıklar • Kalp, iskelet kası, santral sinir sistemi böbreğin yer aldığı bazı dokular mitokondriyal enerji üretimine oldukça bağımlıdır. • Mitokondriyal solunum etkinliğinde nüklear veya mt. DNA mutasyonlarının sebep olduğu yaşla-ilişkili azalmalar bu organ sistemlerinin yetersizliğine katkıda bulunabilir – Egzersiz intoleransı. Mitokondriyal sitokrom b genini etkileyen mutasyonlar neden olur.

Mt. DNA ve Hastalıklar • Mitokondrial genomun mutasyonu sebebiyle meydana geldiği düşünülen bir dizi insan hastalığı vardır. – – – – Premature yaşlanma, kanser, diabetes mellitus, parkinson hastalığı, alzheimer hastalığı, epilepsi, duyu kaybı (duyma ve görme), kas ve merkezi sinir sistemini içeren sendromlar • MERRF, MELAS, NARP, LHON, Miyopati vb. sayılabilir. • Bunun yanı sıra manik depresyon gibi bazı bipolar efektif hastalıklarında mt. DNA mutasyonları ile ilişkisi olduğu düşünülmektedir.

LHON: Leber’in herediter optik nöropatisi – ND 4 mit. geninde tek baz değişimi – Kompleks I’de Arg His değişimine neden olur – NADH’tan ubikinona kısmen bozuk e- transferi – SSS’yi etkiler, optik sinir tutulumu çocuklukta bilateral görme kaybı ile sonuçlanır – Bu mit. ler süksinat üzerinden e- aktararak ATP üretebilmelerine karşın, bu çok aktif nöron metabolizmasını yürütmekte yetersizdir.

MERRF: Myoklonik epilepsi ve Bozuk kırmızı lif hastalığı • Lösine özgü t. RNA’yı kodlayan mitokondri geninde mutasyon • Kontrol edilemeyen kas silkelenmeleriyle tanımlanır • Mit. deki t. RNA’ların sentezlerinde kullanılan çeşitli proteinlerin hatalı üretimi sonucu gelişir. • İskelet kası lifleri anormal yapılı mitokondriler içerir • Mit. Lösil-t. RNA genindeki mutasyonlar erişkin başlangıçlı DM’nin nedenlerinden biridir

Mt. DNA ve Karsinogenez • Bazı çalışmalarda, kanser hücrelerinde mt. DNA mutasyonlarının varlığı gösterilmiştir. • Bazı kanser tiplerinde mt. DNA transkriptlerinin ekspresyonundaki değişimler de gösterilmiştir. • İnsan mitokondrial 16 S r. RNA geninin, potansiyel bir onkopeptid’ i kodladığı gösterilmiştir ve bu peptid yakın zamanda HUMANİN olarak isimlendirilmiştir. • Nöronal hücre ölümünü baskıladığı için Alzheimer (AD) hastalığına karşı bir ilaç olarak düşünülen bu peptid, AD hastalarına uygulandığında malign hastalık gelişimi riskini arttırabilir.

Mt. DNA ve Karsinogenez • mt. DNA mutasyonları, reaktif oksijen türevlerinin üretiminde sürekli bir artışa sebep olabilir, • ROS’ların artışı da mt. DNA’da yeni mutasyonlara sebep olabilir ve bu durum tümör gelişimi için tercih edilen bir durumdur. • Mesane, meme, kolon, baş ve boyun, oral doku, karaciğer, pankreas, akciğer, prostat, tiroid, mide, özafagus kanserleri ve hematolojik malignansilerden lösemi ve lenfomada mt. DNA mutasyonları tanımlanmıştır.

Mt. DNA ve Karsinogenez • Kanser oluşumu ile ilgili mutasyonlar, mt. DNA’nın kodlayıcı olan veya olmayan bölgelerine dağılmıştır. • Bir çok kodlayıcı bölge mutasyonu, Kompleks I bölgesinde bulunmuştur. Kodlayıcı olmayan D-Loop bölgesinde de sıcak noktalar bulunmuştur. • Evrimsel süreçte pek çok mitokondrial genin nükleer genoma transfer edildiği bilinmektedir ve bu transferin hala devam ediyor olabileceği düşünülmektedir. • Gerçekten de mt. DNA’nın fragmentleri bazen nükleer genlerde bulunur ve mt. DNA’nın insersiyonu, onkogenleri aktive eden bir mekanizma olabilir.