Mtodos Analticos em Biotecnologia Mtodos envolvendo cidos Nucleicos

Métodos Analíticos em Biotecnologia Métodos envolvendo Ácidos Nucleicos: • Extração e quantificação; • Enzimas de modificação; • Marcação; • Hibridizações Moleculares; • Desenho de iniciadores; • PCR de várias modalidades; • Clonagem gênica; • Sequenciamento gênico; • Genômica e bioinformática;

Precisamos de um novo olhar para o básico conhecido na estrutura dos ácidos nucleicos para compreender os métodos com mais facilidade

BASES NITROGENADAS Purinas Pirimidinas 5 -Metildicetopirimidina Dicetopirimidina

Base-Pareamento nos ácidos nucleicos

Bases nitrogenadas e ABSORÇÃO DE LUZ U. V.

DOSAGEM DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ABSORÇÃO DE LUZ U. V. D. O 260 nm = 1, 0 corresponde a • 50 g/m. L de DNA dupla fita • 40 g/m. L de DNA ou RNA simples fita • 20 g/m. L de oligonucleotídeos. D. O 260 nm/ D. O 280 nm : fornece a pureza de uma preparação de ácidos nucleicos (1, 8 e 2, 0 para DNA e RNA respectivamente). Valores inferiores indicam contaminação com fenol e proteínas.

Purificação de DNA por gradiente de Cloreto de Césio e visualização por luz U. V. O Cs. Cl tem sua solução aquosa com uma gravidade específica próxima a do DNA. Quando esta solução é centrifugada por um longo período de tempo e em alta velocidade, atinge-se um equilíbrio com a formação de um gradiente de densidade contínuo, com a porção mais concentrada de Cs. Cl no fundo do tubo e a porção menos concentrada no topo.

Tratamento ácido: depurinação

MARCAÇÃO NÃO RADIOATIVA DO DNA VIA BASES NITROGENADAS • DIGOXIGENINA: O DNA é marcado com o glicosídeo digoxigenina-11 -UTP • BIOTINA: O DNA é marcado com biotina • COMPOSTOS FLUORESCENTES: O DNA é marcado compostos fluorescentes como Texas Red.

d. UTP-Digoxigenina d. UTP- Biotina

AÇÚCARES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Ligação P-O sensível a alkali e enzimas

Grupamentos Fosfatos nos ácidos nucleicos

d. ATP

β α As sondas genéticas podem ser produzidas pelo emprego de nucleotídeos marcados com radiosótopos no fosfato α, por exemplo α 32 P.

Ligações Fosfodiéster Ligações fosfodiéster constituem o núcleo principal da vida já que são parte da constituição básica de todos os ácidos nucleicos. A hidrólise das ligações fosfodiester são catalisadas pelas fosfodiesterases (quebra do DNA)

• Etanol e isopropanol: A natureza higroscópica do DNA forma precipitados quando colocado em presença de etanol ou isopropanol e pequenas concentrações de cátions monovalentes.

A: desidratada B: Helicoidal alongada Laboratório de Biofísica do Kings College Química de formação : Rosalind Franklin (1920 -1958): Novembro de 1951 - Cadeia de fosfato-desoxiribose no exterior com bases no interior havendo entre 2 e 4 hélices co-axiais.

Maurice Wilkins 15/12/1916 - 05/10/2004

25 de abril de 1953 - Prêmio Nobel em 1962 junto com Maurice Wilkins) Uma estrutura de ferro e madeira, imitando uma hélice dupla, foi a forma que os biólogos James Watson e Francis Crick encontraram para demonstrar como é a forma da molécula de DNA.

Grupos fosfatos das ligações fosfodiester são carregados negativamente

Por quê o mesmo tamanho molecular pode migrar diferentemente no gel de eletroforese?

Estrutura e propriedades dos RNAs 80% do material genético das células: r. RNA 15%: t. RNA 5%: m. RNA 2%: sn RNA e sc. RNA • Regiões dupla fita (Pontes de H) são rompidas por altas temperaturas e calor (como no DNA!) • Ligações fosfodiester são rompidas por alkalis (NÃO OCORRE NO DNA!!!!)

m. RNA polimerase II: Transcreve os genes do m. RNA (e também o sn. RNA).

Ribosomos são compostos por moléculas de RNA e proteínas formando grandes complexos que compreendem a maior parte da massa de uma célula. O ribossomo tem um coeficiente de sedimentação de 70 S, e pode ser dividido em duas subunidades: 50 S e 30 S. Estas subunidades são compostas por unidades separadas: a subunidade 50 S possui 2 moléculas de RNA, uma de 23 S e outra de 5 S bem como 34 proteínas diferentes. A subunidade 30 S tem como subunidades a molécula de r. RNA de 16 S e 21 proteínas diferentes.

r. RNA polymerase I (Pol I): Transcreve os genes do r. RNA dos precursores 23 S e 16 S RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para o r. RNA 5 S

t. RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para os t. RNAs.