MPLANTASYONUN SIRRI Prof Dr Mehmet Cengiz OLAKOLU Necmettin

İMPLANTASYONUN SIRRI Prof. Dr. Mehmet Cengiz ÇOLAKOĞLU Necmettin Erbakan Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Konya

Uterin Reseptivitenin Tanımı • Embryo implantasyonu için geçici olarak endometriumun uygun hale gelmesine denir.

IMPLANTATION WINDOW • Postovulatuar 6 -10 günlerde açılır, bunun dışında non-reseptiftir. Siklus boyunca optimal hazırlıkların yapıldığı devredir. External hormonlarla bu günlerde oynama yapılabilir.

• Uterin reseptivite gebeliğin devamının sağlanması açısından konseptüsün (embriyonik ve extra-embrionik membranlar) implantasyon ve büyümesinin mümkün olduğu fizyolojik durumdur. • Yetersiz uterin reseptivite implantasyonu olumsuz etkileyerek konseptüsün gelişmesi ve böylece gebeliğin devamı üzerine etki eder. • İnsanlarda ve evcil hayvanlarda gebelik kayıplarının en sık nedenidir.

Endometrial Reseptivite • Sağlıklı embriyonun implantasyonuna izin verir. • Sağlıksız embriyonun ise implantasyonu önlenir. • Endometrium kaliteli bir embriyonun biyo-sensörüdür.

Implantation Process • Human embryo implantation üç aşamalı işlemdir (apposition, adhesion and invasion) functional blastocyst ile reseptive endometrium arasında olur. Bu ovarian steroid bağımlı bir olaydır.

ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYİ ETKİLEYEN GENETİK FAKTÖRLER • Hoxa 10 expressionu • HOXA-10, a homeobox gene whose expression is necessary for endometrial receptivity to blastocyst implantation, has an essential role in pinopod development. Indeed, blocking HOXA-10 expression dramatically decreases the number of pinopods. HOXA-10 illustrates a dual role in the endometrium by regulating both endometrial stromal cell (ESC) proliferation and epithelial cell morphogenesis (Bagot et al. , 2001 ).

ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYİ ETKİLEYEN GENETİK FAKTÖRLER • Uterine sensitization-associated gene-1 (USAG-1), • Endometrial bleeding associated factor (EBAF) • found to be expressed in the late secretory and menstrual phase of the endometrium.

ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYİ ETKİLEYEN HORMONLAR • COH ESNASINDAKİ YÜKSEK ESTROGEN RESEPTİVİTEYİ KÖTÜ ETKİLER

ENDOMETRIAL STEROID RECEPTORLERİ VE RECEPTİVİTE • İmplantasyonda Estrogen ve Progesteron reseptorleri önemlidir. • Luteal fazda , progesteron glandular epitelde PR downregulasyonu yapar. PR downregulation ve pre-implantation integrin expresyonu arasında sıkı ilişki vardır.

ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYİ ETKİLEYEN HORMONLAR Estrogen and progesterone • • • At 527 cycles in subfertile patients, it was found that significantly more viable pregnancies occurred among patients with an estrogen to progesterone ratio in the range of 7. 36 to 12. 22 (calculated as estrogen in pmol/L divided by progesterone in nmol/L). • Yang et al.

Gonadotropin Hormonlar • Periimplantasyon peryodunda LH reseptor sayısı ve LH tarafından işgalleri artar. Bu LH ın implantasyon ve desidualizasyonda önemini gösterir • Bonnamy et al.

Gn. Rh agonist and Gn. Rh antagonist • Agonist ve antagonist tedavilerden sonra düşük LH seviyesi gözlenir. Bu durum korpus luteum fonksion bozukluğu ve kısa luteal fazla beraberdir. • Tavaniotou A, Smitz J, Bourgain C, Devroey P. Ovulation • induction disrupts luteal phase function. Ann N Y Acad Sci • 2001; 943: 55 -63

Gn. Rh agonist and Gn. Rh antagonist • • • In Gn. Rh-agonist cycles, mid-luteal biopsies has revealed increased glandulo-stromal dyssynchrony and delay in endometrial development, strong positivity of endometrial glands for progesterone receptors, decreased cell adhesion molecule profiles with early appearance of pinopodes. These changes suggest a shift forwards of implantation window. Progesterone supplementation improves endometrial histology, and its necessity has been established, at least in cycles, using Gn. Rh agonists • Soliman S, Daya S, Graham RA, Seif MW, Cook ID. The • role of luteal phase support in infertility treatment: a metaanalysis • of randomized trials. Fertil Steril 1994; 61: 1068 -76

YAŞIN ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYE TESİRİ • • • There is significant decline in human fecundity with advancing age. A significant decrement in success rate is also seen in older women undergoing assisted reproduction, including invitro fertilization. Rosenwaks et al. , have observed a drop in the ongoing pregnancy rate per ET, from 48. 8% in women aged < 30 years to 13. 6% in women aged < 42 years. Embryo implantation rates also decline in a linear fashion, from 29% in women < 34 years to approximately 5% at age 42. Borini et al. , found reduced pregnancy rates in patients over the age of 40.

YAŞIN ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYE TESİRİ • The abnormal endometrial receptivity in aging subjects may be due to decreased levels of progesterone receptors promoted by the low levels of E 2 receptors. However, when the progesterone dosage for luteal support was increased, recipients aged over 40 years had a marked increase in pregnancy rate when compared with younger patients.

YAŞIN ENDOMETRİAL RESEPTİVİTEYE TESİRİ • Oosit tükenmesi endometrial reseptiviteyi de bozar. Donor oosit çalışmalarında bu gösterilmiştir. • Navot D, Bergh PA, Williams AM, John Garrisi G, Guzman • I, Sandler B, Rabinowitz R, Birkenfeld A. Poor oocyte • quality rather than implantation failure as a cause of agerelated • decline in female fertility. Lancet 1991; 337: 1375 -7

Endometrial adhesion molekulleri • 4 Ana grup: • integrins, • cadherins, • selectins • immunoglobulin • Springer TA. Adhesion receptors of the immune system. • Nature 1990; 346: 425 -34.

Endometrial adhesion molecules • Integrins are cell adhesion molecules involved in cell-cell and cell-matrix interactions and contributing to cell migration and signal • transduction. Integrins are a family of • • transmembrane glycoproteins that act as a receptor for extracellular matrix ligand, osteopontin (OPN). Three integrins are expressed by the endometrium with a pattern that coincides well with the window of implantation: α 1β 1, α 4β 1, and αvβ 3 are coexpressed on glandular epithelium only during cycle days 20 to 24 corresponding the putative window of implantation. They have been proposed • as the best of the immunohistochemical markers of • endometrial receptivity during implantation window • . Lessey BA. Endometrial integrins and the establishment of

• RESEPTİVİTE BOZULMASINDA • Düşenler • Failure of appearance of a specific integrin – V 3 in the endometrium at the time of implantation was suggested as a cause of implantation failure (Tei et al. , 2003 ; Thomas et al. , 2003 ). • Yükselenler • High levels of aromatase p 450 m. RNA (Brosens et al. , 2004 ), changes in pinopode expression (Pantos et al. , 2004 ) and high matrix metalloproteinases (Inagaki et al. , 2003 ) have been suggested to be associated with RIF.

Endometrial adhesion molekulleri • Mid-luteal integrinler naturale gore indukte sikluslarda dusuk bulunurlar buna "type I defect`` denir. Bu hastalarin cogu progesteronla tedavide hem endometrial histoloji hemde αv β 3 integrinde duzelme olur • Histolojik olarak normal ama αv β 3 Integrin eksik olursa "type II defect", denir. Endometrioz, hidrosalpenks

Vß 3 integrin expression is orchestrated • in the human endometrium • positive [e. g. epidermal growth factor (EGF), heparin-binding EGF (HB-EGF)] and • negative [e. g. 17ß-estradiol (E 2)] factors (Somkuti et al. , 1997 ). • During the proliferative phase, high estrogen levels act via the estrogen receptor- (ER ) to inhibit integrin expression. The luteal progesterone rise subsequently down-regulates the number of those receptors, thus indirectly suppressing the inhibitory effects of E 2 on integrins. This results in a net integrin increase. Progesterone, probably, also acts positively by increasing paracrine stromal factors (e. g. EGF and HB-EGF) to induce epithelial ß 3 integrin expression that serves as the rate-limiting step in Vß 3 formation (Lessey, 2003 )

Aberrant Vß 3 integrin expression pattern has beenassociated with • unexplained infertility (Klentzeris et al. , 1993 ; Lessey et al. , 1995 ; Tei et al. , 2003 ), • endometriosis (Lessey et al. , 1994 b ), • hydrosalpinx (Meyer et al. , 1997 ), • luteal phase deficiency (LPD; Lessey et al. , 1992 ) and, more recently, • polycystic ovarian syndrome (PCOS; Apparao et al. , 2002 ). Other investigators could not, however, demonstrate different integrin pattern in endometriosis (Creus et al. , 1998 ).

Endometrial Anti-Adheziv Moleküller • Embryo uterusun lüminal epitel yüzeyine yaklaşınca glikokaliks denilen müsinöz tabaka ile karşılaşır. • Bu tabakada olan müsinler anti-adheziv moleküllerdir. Muc-1 bunlar içinde en önemli moleküldür. Musinler insan epitel hücrelerinin yüzeyinde bulunan glikoproteinlerdir. • İnsanda bu moleküller peri-implantasyon döneminde yüksek miktarda eksprese olurlar. Peri-implantasyon döneminde Muc-1 miktarının artması blastokisti epitel yüzeyinde diğer inhibitör faktörlerin etkisinden koruduğu düşünülüyor. Tabibzadeh S. Molecular control of the implantation window. Hum Reprod Update 1998; 4: 465 -71

Endometrial sitokinler • Bir sıra sitokinler implantasyonda rol alsa da , en önemli rolü olan 4 grup molekül vardır. 1. 2. 3. 4. Leukaemia inhibitory factor, (LİF) İnterleukin-1, İnterleukin-11 ve Colony-stimulating factor • LİF reseptif faz endometriumdan salgılanır (Danielsson et al. ). Antipreogestin (mifepriston) ile tedaviden sonra LİF için zayıf immün boyama olduğunu göstermiştir. • Koşullara göre LİF’in uterin reseptivitede önemli rolü vardır. Ancak bu günümüzde henüz tam anlamıyla kanıtlanmamıştır. Sharkey A. Cytokines and implantation. Rev Reprod 1998; 3: 52 -61

Endometrial Büyüme Faktörleri 1. Heparin Binding-Epidermal Growth Factor (HBEGF) • Maksimal endometrial reseptivite zamanında ekspresse olur. Yeni çalışmalara esasen, HBRGF’nin hem adezyon hem de embriyonun gelişmesinde rolü vardır. 2. Insulin like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) • Sekretuar endometrium ve desiduanın major ürünüdür. IGFBP-1’in hedef hücrelere etkisini inhibe eder. Endometrial reseptivitedeki rolü daha fazla araştırma gerektirir. Tamada H, Higashiyama C, Takano H, Cohen J, Massey JB, Robinson J, Killick SR. The effects of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor on preimplantation-embryo development and implantation in the rat. Life Sci 1999; 64: 1967 -73

Endometrial İmmun Markerlar • Endometrium implantasyonda iştirak eden bir sıra önemli lymphomyeloid hücre popülasyonları içerir. Açıklanamayan infertilite tanılı kadınlarda fertil kontrol grubuna göre önemli ölçüde düşük CD 8 + (T suppressor/cytotoxic) ve CD 56 + seviyeleri ve • yüksek CD 4+ (T helper/inducer) seviyeleri rapor edilmiştir. Klentzeris LD, Bulmer JN, Warren MA, Morrision L, Li TC, Cooke ID. Lymphoid tissue in the endometrium of women with unexplaned infertility: Morphometric and Immunohistochemical Aspects. Hum Reprod 1994; 9: 646

Mouse Ascites Golgi (MAG) • MAG testi- Endometrial biyopsi ile implantasyondan önce endometrial glandlar tarafından sekrete edilen yapışkan müsinöz maddeyi ölçer. Endometrial Fonksiyon Testi (EFT) sayılır. Fertil kadınlardan alınan endometrial biyopsi numunelerinin %85’den fazlasında menstrual döngünün 5 ve 18. günleri arasında yüksek MAG seviyeleri tespit edilmiş. 19. günden sonra ise ekspresyon gösterilememiştir. Kliman H, Feinberg R, Schwartz L, Feinman M, Laui E, Meawough E. A mucin like glycoprotein identified by MAG (mouse ascites Golgi) antibodies. Menstrual cycle dependent localization in human endometrium. Am J Pathol 1995; 146: 166 -81.

• Dubowy ve ark. endometrial siklin E ve p 27 ekspresyonunu baz alarak endometrial fonksiyon testi geliştirmişler. Bu test endometriumun günlemesi ve normal veya anormal gelişen endometriumu ayırt etmek için kullanılmıştır. Siklin E sitoplazmada bazalden laterale doğru ilerler (midproliferatif faz) ve nucleusa (18. günden 19. güne)ulaşır. 20. günden sonra biyopsilerde saptanmaz. p 27 ilk 17 -19. günlerde ve sadece nükleusta görülür. Duboy. L, Feinberg F, Keefe D et al. Improved endometrial assessment using cyclin E and p 27. Fertil Steril 2003; 80: 146 -56.

EFT • An overview of the EFT, and the key markers behind it, can be found in our July 2003 article Improved Endometrial Assessment Using Cyclin E and p 27, Fertility and Sterility, 80: 146 -56, 2003

Matrix Proteinler • Laminin, • fibronectin , collagen IV are found in secretory endometrium but are absent in the endometrium of patients with unexplained infertility. These suggest that these matrix • proteins are likely to be required for implantation. • Bilalis D, Klentzeris L, Fleming S. Immunohistochemical • localization of extracellular matrix proteins in luteal phase • endometrium of fertile and infertile patients. Hum Reprod • 1996; 11; 271 -18

• Another endometrial protein, glycodelin, has a proposed immunomodulatory role during implantation. This protein is present in the • endometrium under the control of progesterone and • antiprogestins • Muller M, Vinge J, Vaisse C, Taylor R. Glycodelin: a pane • in the implantation window. Semin Reprod Med • 2000; 18: 289 -98.

Morphological Markers

Pinopodes • The endometrium undergoes a well-established series of histological and ultrastructural changes under the influence of estrogen and progesterone • during the menstrual cycle. Morphological • changes include characteristic histological • transformations, such as reduced mitotic activity, • glandular secretion, and stromal edema, that are • often accompanied by the presence of globular • protrusions in the surface membrane of epithelial • cells, named pinopodes. • 70. Noyes RW, Hertig and Rock J. Dating the endometrial • biopsy. Fertil Steril 1950; 1: 3 -25 • 71. Sarantis L, Roche D, and Psychoyos A. Displacement of • receptivity for nidation in the rat by the progesterone • antagonist RU 486: a scanning electron microscopy study. • Hum Reprod 1988; 3: 251 -5

Pinopodes: a questionable role in endometrial receptivity C. E. Quinn R. F. Casper Hum Reprod Update (2009) 15 (2): 229 -236. DOI: https: //doi. org/10. 1093/humupd/dmn 052 • CONCLUSIONS • While there are many publications arising from one group supporting the use of pinopodes as a reliable marker of human endometrial receptivity, few independent groups have been able to confirm these results. The clinical usefulness of pinopodes to delineate a period of endometrial receptivity seems unlikely following recent findings that pinopodes are present throughout the luteal phase of the menstrual cycle.

• Apoptosis is a usual phenomenon throughout the menstrual cycle, peaking at menses, but locally Apoptosis regulated apoptosis is also vital for successful implantation. Recent evidence suggests that regulated apoptosis is important during the window of receptivity. On days 19 -20, apoptosis is detectable in the glands of the basal layer, subsequently extending to the functional layer. The significance of this finding in relation to opening of the implantation window is under investigation. • Galan A, O'Connor E, Valbuena D, Herrer R, Remohi J. The • human blastocyst regulates endometrial epithelial apoptosis • in embryonic adhesion. Biol Reprod 2000; 63: 430 -9.

Human embryo implantation in the uterus. (A) Endometrium proliferates under estrogen enhancement. (B) Progesterone from luteinized follicles leads to endometrial differentiation. (C) The blastocyst enters the uterus through the ostia and rolls freely over the endometrium under signals by L-selectin. (D) Mucin-1 (MUC-1) repels the blastocyst and prevents its adhesion to endometrial areas with poor chances of implantation. (E) Chemokines and cytokines attract the blastocyst to the optimal implantation spot. (F) Adhesion molecules (e. g. integrins and cadherins) firmly attach the blastocyst to the endometrial pinopods to ensure further successful implantation.

Endometrial Reseptivitenin Değerlendirilmesi • Endometrial kalınlık ile konsepsiyon prevalansı arasında düz bağlantı bulunmuştur. Fakat diğer çalışmalar bu görüşü desteklemiyor. Çok ince endometrium (<7 mm), suboptimal implantasyon potansiyelinin güvenilir göstergesi olarak kabul edilir. İmplantasyon ve gebelik oranları endometrial kalınlık artarsa (>14 mm) önemli derecede azalıyor. Bu sonuç da bazı otörler tarafından desteklenmiyor.

Endometrial Reseptivitenin Değerlendirilmesi • Triple çizgi görünümü denilen çok tabakalı ekojenik patern, gebelik açısından prediktif sayılır. Fakat bu pattern olmadan da gelişen daha az sayıda gebelikler mevcuttur. • Midluteal fazda homojen hiperekojen paternin oluşturulamaması düşük gebelik oranlarıyla ilişkilidir.

Endometrial Reseptivitenin Değerlendirilmesi • Uterin arter Doppler ölçümleri endometrial reseptivite için karakteristik değildir. Çünkü burada tüm uterusa gelen kan akımı değerlendirilir. İmplantasyonu öngörmede spiral arter Doppler pulsatilite indexi de yardımcı degildir.

Endometrial Reseptivitenin Değerlendirilmesi • Raga ve ark. üç boyutlu endometrial volümetre uygulayarak endometrial reseptivite üzerine prediktif değerini araştırmaya çalıştılar. Araştırmacı reseptif endometrium için minimal 2 ml hacmin önkoşul olduğunu ve <1 ml endometrial hacimde gebelik oluşmadığını fark etmiştir. İki ml endometrial volümün haricinde, endometrial volumun 2 -4 ml’den > 4 ml yükselişi ile endometrial reseptivite arasında bağlantı görülmemiştir.

Endometrial Reseptivitenin Değerlendirilmesi • Kupesic ve ark. Embrİyo transfer gününde üç boyutlu power Doppler ultrason kullanarak endometriumu değerlendirmiş ve endometrial kalınlık, volüm, endometrial morfoloji ve subendometrial perfüzyonun endometrial reseptivite açısından prediktif değeri olmadığı sonucuna varmışlar. Subendometrial vaskülarizasyon indeksinin endometrial volümü kullanarak İVF gebelik oranını öngörmede daha üstün olduğu görülmüştür.

Endometrial Reseptiviteyi Artırma Stratejileri • Endometrial reseptivitede minimal azalmaya neden olan ve hatta arttıran ovarian stimulyasyon protokolleri geliştirmek • FSH step-down protokolü uygulayarak high responder hastalarda preimplantasyon döneminde estradiol seviyesini azaltarak endometrial reseptiviteyi artırmak. • Normal sikluslara kıyasla suprafizyolojik hormon düzeylerine bağlı kontrollü ovaryan hiperstimulyasyon. • E 2/Progesteron oranını bozan yüksek E 2 seviyesi de endometrial reseptiviteyi high-responder hastalarda kötü etkileyen faktörlerdendir.

Endometrial Reseptiviteyi Artırma Stratejileri • Kontrollü ovaryan hiperstimulyasyona maruz kalan siklusun erken luteal fazı periovulatuvar dönem belirgin yükselen serum progesteron düzeyleri, gelişmiş endometrial histolojik özellikler ve embriyo implantasyonu sırasında endometrial pinopodların kaybı ile karakterize olunur. • Progesteronun erken yükselişi oosit-embriyo kalitesini degil ama endometrial reseptiviteyi kötü etkiler. Bu prematüre endometrium lüteinizasyonuna ve prematüre implantasyon penceresi oluşumuna neden olur.

Endometrial Reseptiviteyi Artırma Stratejileri • Uterin vaskülarizasyonu arttırmak için 1. Düşük doz aspirin 2. L-Arjinin (nitrik oksid donörü) takviyesi uterin kan akımını, endometrial reseptiviteyi ve implantasyonu iyileştirir.

Endometrial Reseptiviteyi Artırma Stratejileri • Patolojik durumları tedavi etmek 1. Luteal faz defekti 2. Uterin kaviteyi bozan fibroidler 3. İntrauterin adezyonlar 4. Uterin septum 5. Hidrosalpinx 6. Endometriozis 7. Autoimmun durumlar-açıklanamayan tekrarlayan gebelik kaybı olan veya multiple başarısız embrio transfer denemesi olan kadınlarda periferik ve endometrial CD 56+ CD 16+NK-hücre sayısı fazla olduğu gösterilmiştir.

• Insan embriyolarındaki çeşitlilik normaldir. • Maternal decidual en iyi embriyoyu seçer. • Çoğunuz embriyo halindeyken bazı anormalliklerle başlamış olabilirsiniz • Bazı anöploid embriyolar implatasyona elverişlidir.

• The ERA Endometrial Receptivity Analysis is a personalized genetic test to diagnose the state of endometrial receptivity in the window of implantation. • This molecular diagnostic tool is used to analyze the expression levels of 236 genes linked to the status of endometrial receptivity, using RNA sequencing taken from the endometrial tissue. Following the analysis, a specific computational predictor classifies the samples according to their expression profile as Receptive or Non-Receptive.

Eve Götürülecek notlar?

• GENÇLERİN VE KENDİNİ GENÇ KABUL EDENLERİN BAYRAMI KUTLU OLSUN