Monomern G proteiny Alice Skoumalov G proteiny proteiny

Monomerní G proteiny Alice Skoumalová

G proteiny = proteiny vázající GTP Ø v aktivním stavu váží GTP Ø regulují mnoho signálních drah a buněčných procesů Heterotrimerní G proteiny = spřažené s receptory § 3 podjednotky (α, β, γ) § α-pojednotka váže GTP, disociace a interakce s efektorem Monomerní G proteiny = malé G proteiny nebo malé GTPázy § aktivita závisí na vázání GTP (aktivní GTP konformace, interakce s efektorem, buněčná odpověď) § katalyzují hydrolýzu terminální fosfátové skupiny (inaktivní GDP-proteiny) GTP

Malé GTPázy ØGDP/GTP-regulované molekulární „přepínače“ (stav „vypnuto“ a „zapnuto“) Ødva konformační stavy, zásadní pro jejich biologickou funkci: GTP-protein „zapnuto“ GDP-protein „vypnuto“ Regulační proteiny: GEFs (guanine nucleotide exchange factors): urychlují výměnu nukleotidů GAPs (GTPase-activating proteins): urychlují GTP hydrolýzu GDIs (guanine nucleotide dissociation inhibitors): inhibují výměnu nukleotidů

Klasifikace malých GTPáz Ø Známo přes 150 proteinů Ø Ras nadrodina příbuzných proteinů, rodiny malých GTPáz: Ø Ras, Rab, Rho, Arf, Rad, Ran, Rheb, Rit

Lipidová posttranslační modifikace malých GTPáz (prenylace) 1. Farnesyltransferasa (Ras): kovalentní navázání C-15 farnesyl isoprenoidu (F) na cystein motivu CAAX 2. Geranylgeranyltransferasa I (Rho): kovalentní navázání C-20 geranyl isoprenoidu na cystein motivu CAAX 3. Geranylgeranyltransferasa II (Rab): kovalentní navázání C-20 geranyl isoprenoidu na cystein motivů CC, CXC, CCXXX

Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) Ø Regulují aktivaci malých GTPáz a návaznou buněčnou odpověď Ø Usnadňují výměnu volného GTP za vázaný GDP

Různé extracelulární signály aktivují Ras pomocí aktivace odlišných Ras GEFs Ø Všechny Ras GEFs mají CDC 25 homologickou doménu, která katalyzuje výměnu nukleotidů Ø Různé Ras GEFs jsou aktivovány odlišně

GTPase activating proteins (GAPs) Ø Urychlují hydrolýzu malých GTPáz Ø Obsahují katalytickou doménu a přídavné domény důležité pro regulaci Ø Mutované Ras proteiny u lidských karcinomů (substituce glycinu 12 nebo glutaminu 61) nereagují na GAPs stimulaci - přetrvává konformace „zapnuto“ - deregulace buněčných dějů

Guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) Inhibují aktivaci dvěma způsoby 1. Váží se a maskují navázaný isoprenoid (prenylace), zabraňují asociaci proteinu s membránou 2. Ruší GAP a GEF regulaci, zabraňují aktivaci proteinu

Struktura malých GTPáz Funkční domény H-Ras 1. G doména: 4 konservované sekvence, odpovědná za vázání GTP a GTPázovou aktivitu 2. Motiv CAAX: Ras a Rho 3. Efektorová doména: vazba s efektorem 4. Switch I a II: odpovědné za změnu konformace mezi GDP a GTP- proteinem 5. RHO sekvence

G doména je podobná u všech malých GTPáz s malými odlišnostmi

Různé funkce malých GTPáz Rozdílné spektrum buněčných funkcí 1. Různé GEFs a GAPs, které jsou aktivovány primárním signálem 2. Různé efektory, které vyústí v mnoho odlišných buněčných odpovědí Přehled funkcí některých malých GTPáz Ras: buněčná proliferace a diferenciace Rab, Arf, Sar: membránový transport (sekrece, endocytosa) Ran: regulátor nukleocytoplasmatického transportu Rho: cytoskelet (regulace metabolismu aktinu), buněčná morfologie, buněčný pohyb

Ras GTPázy Funkce: buněčná proliferace a diferenciace Ø Časté mutace Ras proteinů u nádorů (nejvíce studovány) § Mutace, které blokují GAPs a hydrolysu GTP, udržují Ras proteiny v poloze „zapnuto“ (nalezeny u různých tumorů)

Efektory Ras proteinů Ras funguje jako signální uzel 1. Konvergují v něm různé signály: Růstové faktory (epidermální růstový faktor, destičkový růstový faktor) Hormony (insulin) Cytokiny (interleukin-1) Proteiny extracelulární matrix (přes integriny) 2. Aktivuje rozdílné efektory a buněčné děje: Raf serin/threonin kináza (aktivuje Raf/Mek/Erk kinázovou kaskádu – regulace buněčného růstu) Fosfatidylinositol 3 kináza (tvorba PIP 3 – regulace různých drah) Fosfolipáza Cε (tvorba druhých poslů DAG a Ca 2+) GEFs jiných GTPáz (kaskády malých GTPáz – Ral, Rac, Rab)

Rab GTPázy (Ras homologue from brain) Funkce: membránový transport Ø Největší rodina malých GTPáz (minimálně 60 proteinů) Ø Lokalizovány v organelách zapojených do sekreční a endocytické kaskády Ø Většina Rab se nachází ve všech buňkách, ale např. Rab 3 a v neuronech a Rab 27 v melanocytech a destičkách

Buněčná lokalizace Rab GTPas

Rab proteiny a nemoci Mutace Rab genů-poruchy membránového transportu-onemocnění Griscelli syndrom (AR) Ø Pigmentové defekty, porucha imunity, neurologická dysfunkce Ø Mutace genu Rab 27 a (reguluje transport melonosomů do periferie melanocytů a sekreci lytických granul v T-lymfocytech) způsobí ztrátu pigmentace a nekontrolovanou aktivaci T-lymfocytů Choroideremie (X vázaná) Ø Degenerace pigmentového epitelu oka Ø Defekt REP-1 genu (geranyl transferasa zodpovědná za prenylaci Rab 27 a v retinálním pigmentovém epitelu) vede k deficitu melanosomového transportu v pigmentovém epitelu a ztráta ochrany před světlem

Ran GTPázy (Ras related nuclear protein) Nachází se v každé jaderné buňce, esenciální pro životaschopnost buněk Funkce: 1. Regulace aktivního transportu mezi jádrem a cytoplasmou 2. Tvorba a lokalizace mitotického vřeténka, formování jaderného obalu

Rho GTPázy Ø Rodina proteinů regulující metabolismus aktinu Funkce: Regulace aktinového cytoskeletu (buněčný tvar a pohyb) Modulace nejrůznějších buněčných dějů: 1. Buněčná migrace: regulace metabolismu aktinu, koordinace aktivace mnoha Rho proteinů 2. Sekrece a endocytosa: transport vesikulů 3. Proliferace a transformace: úloha je zkoumána, invaze nádorových buněk

Rho GTPázy Efektory Funkce v buněčné biologii Rho. A, B, C ROCK I, II Aktin-myosinová kontraktilita, buněčná migrace Rac 1, 2, 3 IRSp 53 Polymerizace aktinu, tvorba lamelipodií, hybná síla buněčné migrace Cdc 42 WASP/N-WASP Polymerizace aktinu, tvorba filopodií, sensorická úloha v buněčné migraci

Model Rho GTPasové aktivace efektoru Cdc 42 navozená WASP aktivace a tvorba filopodií

Otázky 1. Princip funkce malých GTPáz, jejich cyklus, regulace, aktivace 2. Nejznámější rodiny malých GTPáz? 3. Princip lipidové posttranslační modifikace? 4. Důsledek mutací Ras proteinů u lidských karcinomů? 5. Struktura malých GTPáz? 6. Funkce Ras proteinů? 7. Funkce Rab a Rho proteinů?