Molekulrs metodes mikrobioloij Teorija 2 Plazmdu DNS izdalana

Molekulārās metodes mikrobioloģijā Teorija 2. Plazmīdu DNS izdalīšana 2016. /2017. mācību gada 2. semestris Māris Lazdiņš 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 1

Plazmīdu vekoru DNS ieguve Plazmīdu DNS ieguvē var izdalīt 3 pamatstadijas: 1. Vektoru saturošo baktēriju audzēšana (arī plazmīdu DNS amplificēšana), 2. Baktēriju savākšana un šūnu lizēšana, 3. DNS izdalīšana un attīrīšana. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 2

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Lai novērstu heterogēna DNS maisījuma ieguvi, ir būtiski sējmateriālu ņemt no vienas kolonijas. Ja materiāls ņemts no muzeja, baktērijas sēj atšķaidījumos, lai veidotos atsevišķas kolonijas. Ja tiek pavairotas rekombinantas plazmīdas no transformētām kultūrām, vēlams paralēli parauga daļu saglabāt muzejā. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 3

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Pēcpusdienā 5 - 10 ml barotnē ar atbilstošo antibiotiku iesēj naktskultūru. Nākamajā rītā 25 ml barotnē ar atbilstošo antibiotiku inokulē 0, 1 - 0, 25 ml naktskultūras. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 4

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Inkubē optimālos apstākļos ar labu aerāciju (piemēram, šūpojot). Nosacījums labai aerācijai - kolbā kultūra nedrīkst būt vairāk kā 1/3 no kolbas tilpuma. Pretējā gadījumā vajadzīga piespiedu aerācija sūknējot cauri gaisu. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 5

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Inokulācijas kultūru audzē līdz vidējai "Log" fāzei - OD 600=0, 6. Tad visus 25 ml inokulē DNS izdalīšanas kultūrā 500 ml tās pašas barotnes ar atbilstošo antibiotiku. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 6

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Lai neapstādinātu straujo augšanu, barotnei jābūt iepriekš uzsildītai līdz vajadzīgajai temperatūrai. Labu aerāciju nodrošina ar aktīvu šūpošanu, izmantojama 2 l tilpuma kolba. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 7

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Straujā augšana un barotņu maiņa nepieciešama, lai saglabātu selektīvo spiedienu un nesaaudzētu lielu masu ar plazmīdu nesaturošām baktērijām. Īpaši būtiski tas ir ampicilīna rezistences gadījumā, jo ß-laktamāzi baktērijas izdala periplazmatiski (barotnē). 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 8

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Col. E 1 (p. MB) atvasinātajām plazmīdām bez kopiju skaita kontroles (piemēram p. UC sērija) šūnas audzē 4 -5 stundas (OD 600=0, 8 -1, 0). 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 9

Vekoru saturošu baktēriju audzēšana Liela mēroga p. DNS izdalīšanai. Col. E 1 (p. MB) atvasinātajām plazmīdām ar ierobežotu kopiju skaitu (piemēram p. BR sērija) šūnas audzē 2 stundas (OD 600=0, 4) un tad veic plazmīdu amplifikāciju ar hloramfenikolu (12 -16 stundas). Plazmīdu amplifikācijas vajadzībām hloramfenikolu barotnei pievieno ar beigu koncentrāciju 125 - 170 mg/ml 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 10

Hloramfenikols - (arī hloromicetīns, levomicetīns). Plašas iedarbības bakteriostatiska antibiotiska viela, kuru atklāja 1949. gadā aktinobaktērijās (aktinomicētēs). Pašlaik iegūst tikai sintētiski. Hloramfenikolam piemīt bakteriostatisks efekts - tas saistās pie baktēriju ribosomas 50 S subvienības un inhibē peptidil-transferāzes aktivitāti - peptīdsaites veidošanu. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 11

Col E 1 (p. MB) ORI Col. E 1 ORI ir relaksēta replikācijas kontrole. Replikācijai nepieciešami vairāki baktērijas genoma kodēti proteīni: RNS polimerāze, DNS polimerāze III, RNāze H, helikāze (Dna. B). 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 12

Col E 1 (p. MB) ORI Replikācija notiek vienā virzienā. Plazmīdas replikāciju kontrolē trīs pašā plazmīdā ietvert gēnu produkti: - RNS I gēna produkts - RNS I, - RNS II gēna produkts - RNS II, - rop gēna produkts - Rop proteīns. Rop - repressor of primer 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 13

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: E. coli RNS polimerāze sintezē RNS II (apmēram 550 nt). RNS II ORI rajonā izveido sekundāro struktūru RNS II ORI 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 14

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: Sekundāro struktūru atpazīst RNāze H un katalizē daļēju RNS II molekulas hidrolīzi. RNS II ORI 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 15

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: Plazmīdas ORI rajonā, veidojas sapārots DNS/RNS himērs ar brīvu -OH grupu 3’ galā, kas kalpo par praimeri DNS polimerāzei I, lai uzsāktu DNS replikāciju. RNS II D DNS pol I ORI 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 16

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: Replikāciju kontrolē RNS I, kura ir komplementāra RNS II 5’ daļai, un, veidojot RNS I - RNS II dimēru, izmainās RNS II sekundārā struktūra RNS II ar izmainītu struktūru vairs nav RNāzei H noderīgs substrāts un praimeris netiek izveidots. RNS II RNS I 31. 03. 2017 ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 17

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: RNS I tiek sintezēta no plazmīdas DNS. Jo šūnā vairāk plazmīdu, jo lielāka ir RNS I koncentrācija - attiecīgi, pieaug iespēja, ka tā efektīvāk saistīsies ar RNS II un kavēs jaunas DNS replikācijas uzsākšanos. RNS II RNS I 31. 03. 2017 ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 18

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: Negatīvajā regulācijā līdzdarbojas plazmīdas kodēts proteīns - rop. Tas specifiski saistās ar RNS I/ RNS II dimēru un papildus nostiprina tā struktūru, vienlaicīgi samazinot iespējamību sākties jaunai plazmīdas replikācijai. rop RNS II rop rop 31. 03. 2017 RNS I ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML rop 19

Col. E 1 ORI Replikācijas iniciācija: Jo vairāk plazmīdas kopiju - vairāk RNSI, - vairāk proteīna - rop => => Mazāka iespēja sākties jaunai plazmīdas replikācijai. RNS II rop 31. 03. 2017 RNS I rop ORI LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML rop 20

Plazmīdu amplifikācija Antibiotiska viela - hloramfenikols specifiski saistās ar prokariotu ribosomām, traucējot proteīnu sintēzi. Hromosomas replikācijas uzsākšanai nepieciešama dažādu jaunu proteīnu sintēze. Plazmīdu replikācijai vajag stabilus enzīmus - RNS polimerāzi II, DNS polimerāzi I un III, RNāzi H. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 21

Plazmīdu amplifikācija Šie enzīmi atrodas citoplazmā salīdzinoši lielā daudzumā. Hloramfenikols kavē salīdzinoši nestabilā Rop proteīna sintēzi. Līdz ar to, inkubējot baktērijas vidē ar lielu hloramfenikola koncentrāciju, iespējams vairākkārtīgi palielināt Col. E 1 grupas (un citu, bet ne visu) plazmīdu kopiju skaitu šūnās. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 22

Šūnu savākšana Baktērijas savāc centrifugējot 0 o. C 5 -10 min. pie 4000 - 6 000 g. Dažreiz iegūtās DNS kvalitāte uzlabojas, ja baktērijas mazgā resuspendējot 100 - 200 ml 0 o. C STE bufera: 100 m. M Na. Cl; 10 m. M Tris-HCl, p. H 7, 8; 1 m. M EDTA. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 23

Plazmīdu atdalīšana Plazmīdu DNS ieguve balstās uz atšķirībām starp p. DNS un genomiskās DNS fizikālajām īpašībām. p. DNS izdalīšanā tiek ietvertas DNS denaturēšanas stadija, kurā lielā genomiskā DNS tiek daļēji sabojāta, bet p. DNS paliek cirkulāru molekulu veidā. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 24

Plazmīdu atdalīšana Praktiski visās plazmīdu DNS ieguves metodēs tiek lietota secīga DNS denaturēšana un renaturēšana. Garie, dažādās vietās fragmentētie genomiskās DNS pavedieni renaturējas lēni un nepareizi, kā rezultātā to vairums paliek daļēji denaturētā un mazšķīstošā formā. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 25

Plazmīdu atdalīšana 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 26

Plazmīdu atdalīšana Na. OH, SDS - sārmainā DNS denaturēšanās. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 27

Plazmīdu atdalīšana DNS renaturēšana (paskābināts Na-acetāts) Cirkulārās, lielā kopiju skaitā esošās p. DNS molekulas ātri renaturējas un atrodas šķīdumā. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 28

Šūnu lizēšana Parasti tiek apvienota ar DNS denaturēšanu. Populārākās metodes ir: - apstrāde ar palielinātu temperatūru (vārīšanu) un - sārmainā līze SDS klātbūtnē. Abās metodēs baktēriju šūnapvalku lizēšanu iesaka uzlabot, izmantojot lizozīmu (gala konc. 2 -5 mg/ml). Lizozīma darbība ir efektīvāka, ja vides p. H vienāds vai lielāks par 8, 0. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 29

Šūnu lizēšana Metode ar vārīšanu ir ātrāka, taču šeit ir problemātiska pareizā vārīšanas laika izvēle. (atbilstoši lietotajam tilpumam, "trauka" formai un temperatūras apmaiņas efektivitātei) Nepieciešama liela ātruma centrifugēšana (ultracenrifugēšana). Tiek izmantots deterģents Trtons-X 100. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 30

Šūnu lizēšana Sārmainās līzes metode rit ilgāka, taču iznākums ir drošāks. Savāktās šūnas resuspendē ~ 10 ml I šķīduma un tur 5 min. istabas temperatūrā. I šķīdums (GTE): 50 m. M glikoze; 25 m. M Tris-HCl, p. H 8, 0; 10 m. M EDTA; (lizozīms 5 mg/ml). 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 31

Šūnu lizēšana Baktērijas jāuzduļķo viendabīgā masā, jo salipušo šūnu pikas netiks nolizētas! Pievieno 2 tilpumus svaigi pagatavota (!) II šķīduma: 0, 2 N Na. OH 1, 0 % SDS. Samaisa invertējot un tur 5 -10 min. (ilgāk nevajadzētu) ledus vannā. Izteikti sārmainā vide denaturē DNS. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 32

DNS sārmainā denaturēšana Heterociklisko bāzu tautomerizācija - tautomērās formas veidošanās. Keto - forma (pamatforma) Enol - forma (ļoti īslaicīga) Guanīns Timīns 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 33

Enol -formas Par enoliem sauc spirtus, kuros -OH grupa piesaistīta C atomam, kurš vienlaicīgi veido arī dubultsaiti ar kādu citu atomu. C OH | C C Enolu -OH grupa spēj disociēt vidē H+ jonu, veidojot enolātu anjonus vai enolātus, kuri ir stabilāki savienojumi. H+ C 31. 03. 2017 O| C C LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 34

DNS sārmainā denaturēšana Stipri sārmainā vidē (p. H>10) enol-formas zaudē protonu un kļūst par enolātiem. Enolāti - samērā stabila forma Enolāts OHGuanīns Timīns 31. 03. 2017 OH- LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML + H 2 O 35

DNS sārmainā denaturēšana Ūdeņraža saites starp komplementārajiem heterociklisko bāzu pāriem, kuras nodrošina DNS divpavedienu struktūru. A-T G-C 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 36

DNS sārmainā denaturēšana Sārmainās vides ietekmē starp komplementārajiem heterociklisko bāzu pāriem veidojas nepietiekams ūdeņraža saišu skaits, lai saglabātu DNS divpavedienu struktūru. X A-T X X G-C 31. 03. 2017 X LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 37

NS sārmainā denaturēšana Šādu metodi mēdz izmantot DNS molekulām. RNS sārmainā vidē ir ievērojami nestabilākas kā DNS, līdz ar to RNS molekulām sārmaino denaturēšanu parasti neveic, vai arī tas jādara precīzi kontrolējot denaturēšanas apstākļus (vides p. H, temperatūra, sārma iedarbības laiks u. c. ). 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 38

DNS renaturēšana DNS renaturēšanos un vienlaicīgi arī nepilnīgi renaturētās genomiskās DNS un daļēju proteīnu izsālīšanu panāk, pievienojot 1/2 tilpuma paskābinātu kālija vai nātrija acetātu (p. H 4, 8; K+/Na+ 3 M, acetāts 5 M). Samaisa lēni invertējot un tur 10 min. ledus vannā. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 39

p. DNS atdalīšana Nepilnīgi renaturēto genomisko DNS un izsālītos proteīnus atdala centrifugējot. Plazmīdu DNS kopā ar RNS frakciju izgulsnē pievienojot 0, 6 tilpumus konc. izopropanola (2 tilpumus konc. etanola). Samaisa invertējot un tur 15 min. istabas temperatūrā. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 40

p. DNS atdalīšana NS savāc centrifugējot. Pazeminātā temperatūrā var notikt sāļu kristalizēšanās! Nogulsnes mazgā ar 70% etanolu, apžāvē un šķīdina TE buferī vai ūdenī. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 41

p. DNS attīrīšana Vēlama vēl papildus attīrīšana. Var veikt: - centrifugāciju cēzija hlorīda gradientā; - RNS izgulsnēšanu ar Li. Cl; - RNS noārdīšanu ar RN-āzi; - fenola/hloroforma ekstrakciju, lai labāk atbrīvotos no proteīniem; - precipitāciju ar polietilēnglikolu, lai atbrīvotos no īsiem NS fragmentiem; - DNS hromatogrāfisku attīrīšanu u. c. 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 42

p. DNS izdalīšana un attīrīšana Solis p. DNS izdalīšanas protokolā. 15. 22. 24. 26. 33. 18. . 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 43

p. DNS 123456 dimēri LF OC LF SC 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML CCC 44

. . . 31. 03. 2017 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML 45