MOLEKULRN DIAGNOSTIKA MIKROORGANISM 2015 Tmata pednek Molekulrn diagnostika

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA MIKROORGANISMŮ 2015

Témata přednášek Molekulární diagnostika mikroorganismů, JS 2015 26. 2. J. Doškař: Úvodní přednáška. Seznámení s obsahem předmětu pro r. 2015, Struktura genomu bakterií. 5. 3. R. Pantůček: Metody používané v diagnostice bakterií 12. 3. V. Růžičková: Molekulární diagnostika prionů a retrovirů 19. 3. E. Jansová: Správná lab. praxe v molekulární mikrobiologické diagnostice 26. 3. P. Hložek: Standardizace a validace, statistické metody v rutinní mol. mikrobiologické diagnostice 2. 4. P. Králík: Molekulární detekce a typizace mykobakterií 9. 4. L. Eyer: Molekulární detekce a typizace virů 14. 4. M. Sittová: Diagnostika vybraných skupin mikroorganismů 16. 4. I. Rychlík: Molekulární diagnostika salmonel. Moderní metody sekvenování DNA. 23. 4. T. Gelbíčová: Detekce a typizace bakteriálních původců alimentárních onemocnění 30. 4. Téma bude upřesněno Po přednáškách budou následovat exkurze na vybraná externí pracoviště, termín dle dohody.

DOPORUČENÁ LITERATURA o o o o Gerhard P. ed. Methods for general and molecular bacteriology, ASM Press 2007. Persing D. H. ed. Molecular Microbiology – Diagnostic Principles and Practice, ASM Press, Washington, 2011 Hacker J. et al. : Genome plasticity and infectious diseases. ASM Press, Washington, 2011. Miller R. V. , Day M. J. : Microbial evolution – Gene establishment, Survival and Evolution. ASM Press, Washington, D. C. , 2004. Snyder L. , Peters JE, Henkin TM, Champness W. : Molecular genetics of bacteria, 4 nd ed. , ASM Press 2013. Dale J. W. , Park, C. F. : Molecular genetics of bacteria, 4 nd ed. John Wiley & Sons, Ltd. 2004 Prezentace přednášejících na ISu

Mozaikovitá struktura bakteriálního genomu – příčina jeho plasticity a dynamiky replikony Chromozom/y Plazmid/y VGE – variabilní složka genomu HGT Plazmidy Inzerční sekvence Konjugativní transpozony Transpozony Genomické ostrovy Profágy Integrony, superintegrony

Variabilní genetické elementy (VGE) (20 % genomu S. aureus) Chromozomové kazety rezistence k meticilinu (SCCmec) Jedinečné ostrovy patogenity (Sa. PI) Společné genomické ostrovy Profágy Lokus přídatného genového regulátoru (agr) Integrované plazmidy Repetitivní elementy (STAR) Inzerční sekvence a transpozony

Genetické elementy Ostrovy patogenity Označení Faktory virulence nebo jiné funkce Enteropatogenní E. coli PAI Adhesiny, hemolyziny, cytotoxiny Enterohemorhagické E. coli LEE (esp-LEE) Adhesiny, enterotoxiny Vibrio cholera O 1, 0139 VPI (vibrio path. island) Pilusy, regulace Staphylococcus aureus TSST-1 -PAI (Sa. PI 1 aj) Exotoxinový PAI Enterotoxinový PAI Toxin toxického šoku Exotoxin Enterotoxin E. coli, Shigella dysenteriae Lokus chu. A a shu. A Příjem hemu Salmonella enterica sv. Typhimurium Lokus msg. A/pag. C Protein vnější membrány, přežívání v makrofágách Streptococcus pyogenes Oblast vir proteázy E. coli (mimo střevo) p. Hly, Vir plazmidy Hemolyzin, cytotoxický nektrotizující faktor intestinální E. coli p. O 157, Vir plazmidy Adheziny, enterotoxiny, kataláza, hemolyzin Shigella flexneri p. WR 100, p. WR 501 Invasiny, enterotoxin Clostridium tetani p. CL 1 Tetanový toxin Clostridium botulinum c. I Botulotoxin A, B Corynebacterium diphtheriae b Difterický toxin A, B E. coli (enterohemorhagické) H 19, 933 Shiga toxin A, B S. aureus f 42 Enterotoxin A, B V. cholerae CTXf Cholerový toxin A, B Ostrůvky patogenity Plazmidy Bakteriofágy

Struktura genomu bakterií – typy replikonů u jednotlivých druhů Počet kopií chromozomu: 1 -40/buňku (haploidie, ~polyploidie) MCLR – multiple chromosome-like replicons – známy u 44 druhů

Pangenom (supra-genom) Soubor genů u daného druhu bakterií nebo archeií - odpovídá počtu všech genů zjištěných u kmenů daného druhu – obsah a forma genů u různých kmenů se výrazně liší. „Core“ genom – geny přítomné u všech kmenů Variabilní genetické elementy - postradatelná část genomu – geny přítomné jen u dvou nebo více kmenů Jedinečné geny – geny vyskytující se pouze u jednoho kmene Pangenom určitého bakteriálního druhu může být řádově vyšší než jsou genomy jednotlivých kmenů

Původ genetické heterogenity u bakterií a její důsledky

TYPY SEKVENCÍ PROKARYOTICKÉHO GENOMU o Kódující oblasti n n n Geny (ORF) se známou nebo neznámou funkcí Inzerční sekvence a transpozony Profágy (a defektní profágy) o Sekvence přepisované do RNA (r. RNA, t. RNA) o Repetice n n n Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Krátké roztroušené repetitivní sekvence Dlouhé roztroušené repetitivní elementy Mosaikové repetitivní elementy Chi-místa a jim podobné sekvence Rhs elementy 90% 10%

TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH A. o o o Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Trinukleotid TGG – nejčastější trinukleotid E. coli (součást penta nebo oktanukleotidů) Nonamer AAGTGCGGT (uptake signal sequence – USS) H. influenzae - 1465 kopií Tandemově opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n nebo (GCC)n - vysoce repetitivní u E. coli, S. typhimurium a Shigella sp. Short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences - heptanukleotidová opakování u sinice Calothrix Major polymorphic tandem repeat (MPTR) - polymorfní 10 -bp DR u Mycobacterium tuberculosis a dalších mykobakterií (podobnost s místy Chi a roztroušenými REP elementy)

TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH B. Krátké roztroušené repetitivní sekvence (kratší než 50 bp) o o REP (repetitivní extragenové palindromatické sekvence) 38 bp, 500 REP u E. coli PU (palindromic units) u E. coli a S. typhimurium. Mnohokopiový 26 -mer (Ngrep) u Neisseria gonorrhoeae a N. meningitidis Mnohokopiový 24 -mer DR element u Mycobacterium bovis (38 kopií)

TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH C. Dlouhé roztroušené repetitivní elementy (větší než 50 bp) o o o o intergenic repeat unit (IRU) enterococcal repetitive intergenic consensus (ERIC) 126 bp nebo zkrácené formy. Chromozomová lokalizace se liší u kmenů a druhů ERIC-like sekvence – celá bakteriální říše. RLEP (545 - 1063 bp) u Mycoplasma leprae 28 (0, 6% genomu) Mx-rep u Myxococcus xanthus - 87 pb jádrová sekvence Dr-rep (SARK) u Deinocccus radiodurans Element o variabilní délce (150 -192 bp) Rep. MP 2, Rep. MP 1, SDC 1 (150 bp – 1 kb) u Mycplasma pneumoniae, v genomu 8 -10 kopií. Rep. MP 2 -like u Staphylococcus

Evoluce lokusu CRISPER – zdroj polymorfismu, možnost pro genotypizaci

Přehled metod pro diagnostiku mikroorganismů

Genotyping methods used in bacteria A. Methods without DNA amplification Restriction endonuclease analysis PFGE of DNA macrorestriction fragments Field inversion gel electrophoresis Small fragment restriction endonuclease analysis Selective restriction fragment hybridizatin Ribotyping IS typing Prophage profiling Plasmid profiling Restriction endonuclease analysis of plasmids

B. Methods with DNA amplification PCR-gene RFLP typing Multiplex PCR RAPD or arbitrarily primed PCR Binary typing Interrepetitive PCR Amplified fragment length polymorphism and IRS-PCR infrequent-restriction-site amplification Ribosome spacer PCR or PCR ribotyping t. DNA intergenic spacer length polymorphism Multiple-locus variable numbers of tandem repeat analysis PCR-gene SSCP typing Cleavase fragment length polymorphism Direct sequencing Multilocus sequence typing Innovative high-throughput molecular methods Quantitative PCR Denaturing gradient gel electrophoresis DNA microarrays Fluorescence in situ hybridization with peptide nucleic acid probes Isothermal signal-mediated amplification of RNA technology

Model vzniku ostrovů patogenity u patogenních E. coli Kmeny E. coli adaptované na různá prostředí plazmid Fág (shiga toxin) Enterohemolytické k. t. RNA, att plazmid Původní genom Enteropatogenní k. Uropatogenní k. plazmid

Vznik genomických ostrovů u patogenních a environmentálních mikrobů Přenos fágem