Molekulris klnozs a gyakorlatban CRISPRCas rendszerek Adaptv bakterilis
Molekuláris klónozás a gyakorlatban
CRISPR/Cas rendszerek • Adaptív bakteriális immunitás • Idegen nukleinsavak ellen ( pl. vírusok) • Ezek integrálása a genomba, rövid, ismétlődő szekvenciák közé • RNS alapú felismerés ( guide RNS), RNS mediált DNS hasítás, degradáció a Cas endonukleázokkal -> Számos géntechnológiai applikáció : specifikus géncsendesítés, represszió, aktiváció
A plazmid alapú molekuláris klónozás alapsémája
Kazettacserés klónozás • 2 -es plazmid ampicillin rezisztenciájú, valamiért nem működő plazmid • 1 -es plazmid az előzővel megegyező, klóramfenikol rezisztenciájú, jól működő • Kazettacsere: 1 -es plazmid backbone-t megtartjuk, 2 -es plazmidból rezisztenciagén átemelése • Az így kapott 3 -as plazmid a 1 -es vektorral megegyező, de már ampicillin rezisztenciájú plazmid lesz • Vajon működik?
2 -es plazmid Ampicillin rezisztencia
1 -es plazmid Klóramfenikol rezisztencia
3 -as plazmid 1 -es plazmid backbone 2 -es plazmid rezisztencia
I. Plazmidok emésztése • Sac. I-val és Eco 88 I-vel mindkét plazmid -> egyforma túlnyúló végek • Double digest
Double digest Ideális
Emésztett vektorok 3 -as plazmid 1 -es plazmid: 2 -es plazmid:
• Emészési elegy: 1 -es plazmid 2 -es plazmid DNS 34 µl (ami 2µg-nak felel meg) 15, 49 µl (ami 2µg-nak felel meg) Sac. I 1 µl Eco 88 I 1 µl Tango puffer 4 µl 2 µl Mq - 0, 51 µl ∑ 40 µl ∑ 20 µl -> 2 óra inkubálás 37 °C-on
II. Gélből izolálás • 0, 6 %-os agaróz gél a DNS izolálásához • 6 x-os LD (Loading Dye) pre-mixed puffer • 20 perc futtatás után: Ø 1 -es plazmidból 5523 -as csík Ø 2 -es plazmidból 1216 -os csík
III. Nucleospin • DNS izolálása gélből • 2 x-es NTI a mintához képest • Oszlopra pipettázás, fugálás • NT 3 -al mosás • 70 °C-os vízzel eluálás az oszlopról • Koncentráció mérés Nanodroppal
DNS linker ligálása vektorba Rezisztenciagén Origó
A klónozás célja Eco. RI ár • A Cas 9 fehérjéhez guide RNS kicserélése -> más DNS szakaszt hasít • Eco. RI hasítóhely eltüntetése: • ha ezzel hasítjuk, a kiindulási vektorokat megvágja, a terméket nem • olcsó Termék, Eco. RI hasítóhely nélkül Kiindulási vektor
Vektor emésztése • Bpi. I restrikciós endonukleáz • Type II S : • a felismerő hely nem azonos a hasítás helyével • A hasítás során kivágódik a felismerő hely • Ha az inszert beépül : az enzim nem tud vágni • Ha az inszert nem épül be : újra megvágja
A Bpi. I enzim hasító- és felismerőhelye Hasítóhely Felismerőhely Hasítóhely
Megfelelő puffer kiválasztása • Minden enzim egy adott p. H-n és közegben működik a leghatékonyabban • Különböző előre összeállított pufferek állnak rendelkezésre ( Thermo Scientific cég) • Bpi. I : G pufferben a leghatékonyabb
DNS linker ligálása vektorba • Linker : - Szintetikus hibridizált komplementer oligonukleotidok - Hibridizálás PCR készülékben : 95˚C-ra felmelegítés, lassú hűtés(1, 5 óra ) 4 ˚C-ra • Túlnyúló végek : a klónozáshoz tervezve, egy orientációban épülhet be DNS linker Eco. RI hasítóhely nélkül
Ligálás Kiindulási vektor DNS linker Termék
Ligálás • Ligálási elegy: insert, vektor, ligáz, ATP, puffer, mq 30 perc inkubálás szobahőmérsékleten Ligáz inaktiválás 70 °C-on 5 percig 50 ng vektor+ x insert ng=(3 x vektor ng x insert bp)/vektor bp • Visszavágás: egy olyan enzimmel emésztjük meg a ligálási elegyet, ami a kiindulási plazmidban megtalálható, a kész termékben nem
Transzformálás baktériumba • Kompetens sejtek készítése / vásárlása • Plazmid bejuttatása : Hősokk ( 42˚C-on 1 percig) • Antibiotikum-mentes LB médiumba rázatás • Szelekciós táptalajra szélesztés (gyöngyökkel) • Overnight inkubálás • A kívánt telepek leoltása
Miniprep készítése tesztemésztéshez • Miniprep : Alkalikus lízisen alapuló DNS izolálás / tisztítás 10 -100µg DNS izolálására alkalmas • Előtte minden telepből glicerines baktériumminta elrakása -80 ˚C-ra • Többféle puffer segítségével nyerhető ki a DNS: • P 1: RN-áz tartalmú izotóniás oldat • P 2: sejtek lizálásához szükséges oldat • P 3: Fehérjék, és a genomi DNS kicsapásához szükséges oldat • Ezután a DNS alkoholos kicsapása következik(izopropanol), majd az alkohol szárítása • Végül nukleáz-mentes vízbe rakjuk a kinyert DNS-t.
Tesztemésztés • Leoltott telepekből a megfelelő klónok kiválasztása • Enzim kiválasztása : • A kiindulási plazmid, és a klónok szekvenciájában vannak különségek • Ugyanazzal az enzimmel való hasítás : más fragmentumok keletleznek Kiindulási vektor Jó klón
Tesztemésztés Kiválasztott enzimek : Bsa. I , Eco. RI NINCS Eco. RI VAN Eco. RI Kiindulási vektor Jó klón
Tesztemésztés A kiválasztott enzimek : Eco. RI , Bsa. I • A klónnál : Jó klón • A kiindulási vektornál : Kiindulási vektor • Agaróz gél szimuláció : • Látható a különbség Jó klón Kiindulási vektor
Szekvenálás • Szekvenálásra küldés előtt nucleospin (tisztítás) • Sanger féle szekvenálás • Megfelelő szekvenáló primerek kiválasztása
VÉGE
- Slides: 28