Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode I DNA 17 12
Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode I. DNA 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 1
DNA-Struktur n n Primärstruktur: Sequenz der Nucleotiden, lineare Polymer, Phosphodiestherbindungen Sekundärstruktur: Doppelhelix, H-Brücken Tertiärstruktur: Superhelix Quarternärstruktur: DNP, Chromatin 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 2
Sekundärstruktur n Die Faltung der Makromolekül n Nichtkovalente Bindungen DNA n Doppelhelix n stabilisiert durch H-Brücken 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 3
Hybridiesierung n In vivo: n Enzymatisch (DNA-Replikation, Transcription) n In vitro: Wärme (PCR) n alkalische Lösungen (Southern-blot) n Formamid und Harnstoff (Sequenzierung) n 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 4
Denaturierung: n Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur n nichtkovalente-Verbindungen Hydrolyse: n Primärstruktur n kovalente Verbindungen 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 5
UV-Absorption der DNA n Absorptionsmaximum : 260 nm n Konzentrationsbestimmung n Bei Denaturierung steigt der UV- Absorption 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 6
Schmelztemperatur -Tm n diejenige Temperatur, bei der sich 50% der DNA-Stränge trennen n steigt mit zunehmenden G/C- Gehalt der DNA (3 H-Brücken) 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 7
Molekularbiologische Methoden n n n 17. 12. 2021 Restriktionsendonucleasen Cloning Molecular hybridisation Southern blot Sequencing PCR Genom library Sebők Ágnes 8
Filter-Hybridisierung Denaturierung n Filterbindung n Hybridiesierung mit der Probe (radioaktive) n Waschen n Radiokativität messen n Fragen: n Anwesenheit der komplementäre Strang n Quantität der komplementären DNA/RNA 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 9
In situ Hybridisierung n n n Mikroskopisches Preparat Denaturierung Hybridiesierung mit der Probe (fluorescent) Waschen Fluorescent Mikroskop (Lichtmikroskop) Fragen: n Anwesenheit des komplementären Stranges n Wo? 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 10
Die Restriktionsendonuclease n Nuclease – schneidet Phosphodiesterbindungen in Nucleinsäure n Endo/Exo – Nuclease n Restriktion – Erkennungstellen bzw. Bakterielle Restriktion. Modifikations-System 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 11
Die Restriktionsendonuclease n ds. DNA-specifische Endonuclease, mit einer specifischen Erkennungssequenz n Palindrom n adhäsive oder glatte Ende 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 12
Restriktionskarten n Verdau mit RE n Agarose Gelelectrophorese n Wanderung zur positiven Electrode n Größere Fragmente wandern langsamer n Fluoreszierende Farbstoff die an DNA bindet n Relative Lagerung der REErkennungsequenzen kann determiniert werden. 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 13
In Vitro DNA-Synthese n DNA-Polymerase n DNA-Matrize n Primer n 4 d. NTPS , ein radioaktiv markiert n Puffer ****** n Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 14
Enzymatische DNA-Sequenzierung In vitro DNA-Synthese n Primer (oder d. NTP) radioaktiv markiert n dd. NTP (die 3’-OH-Gruppe fählt) n 4 in vitro Reaktionen mit 4 verschiedenen dd. NTPs (1: 10) n Denaturierende Electrophorese (PAGE mit Harnstoff und Formamide) n Autoradiographie n 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 15
Polymerasekettenreaktion (PCR) n In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar n Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung (60 -70 C) n 17. 12. 2021 Gelelectrophorese Sebők Ágnes 16
PCR n Existenz einer Sequenz in der DNA -Mischung n Klonierung (Amplifizierung) n Länge der DNA-Fragment Mutationsanalyse 17. 12. 2021 Sebők Ágnes 17
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