MOLEKLER BYOLOJ 2 Hafta DNA Replikasyonu 1 DNA
MOLEKÜLER BİYOLOJİ 2. Hafta DNA Replikasyonu 1
DNA replikasyonu • Replikasyon (kendini eşleme) hücre bölünmesinden önce bütün genetik materyalin tam bir kopyasının yapılması sürecidir • Replikasyon hücredeki kalıtsal molekül miktarının iki katına yükselmesi anlamına gelmektedir. 21 Eylül 2017 Perşembe 2
DNA replikasyonunu sağlayan polimerazlar 1955: Arthur Kornberg E. coli ile çalıştı. Bu bakterinin DNA polimeraz enzimini Karakterize etti ve in vitro koşullarda DNA sentez mekanizmasını keşfetti Replikasyon için gereeken 4 ana bileşen 1. 2. 3. 4. d. NTP’ler: d. ATP, d. TTP, d. GTP, d. CTP (deoksiribonükleozit 5’-trifosfatlar) (şeker-baz + 3 fosfat) DNA kalıbı DNA polimeraz I (Kornberg enzimi olarak da bilinir) Kornberg sadece DNA Polimeraz I enziminin replikasyonda rol aldığını kabul etmiştir ancak mutasyonlar böyle olmadığını göstermiştir. (DNA polimeraz II & III daha sonra bulundu) Mg 2+ (DNA polimeraz aktivitesi için gerekli) 21 Eylül 2017 Perşembe 1959 3
DNA polimeraz I’in katalizlediği kimyasal reaksiyonun her basamağında d. NTP’ler yapıya eklenir. Kalıp DNA molekülünün hem primer hem de kalıp olarak işlev göstermesi gerekir Uzayan DNA zincirine her bir nükleotidin katılım şekli DNA pol I’in özgüllüğüne bağlıdır. Öncü d. NTP’de deoksiribozun 5’ karbonuna bağlı fosfat grubu, ekleneceği deoksiribozun 3’-OH grubuna kovalent bağlanır. Böylece zincir uzaması 5’ 3’ yönünde devam eder. 21 Eylül 2017 Perşembe 4
Ancak DNA pol I’in biyolojik fonksiyonu Kornberg tarafından tam olarak aydınlatılamamıştı, çünkü; • Enzimin in vitro sentez hızı in vivo ya göre çok yavaştı • Tek zincirli DNA’yı çift zincirli DNA’dan daha etkin biçimde kopyalamaktaydı • DNA’yı sentezlediği gibi aynı anda parçalayabilmekteydi • Kornberg- “DNA pol I; in vitro ortamda biyolojik olarak aktif DNA sentezleyebiliyorsa, hücre içinde de DNA sentezinin başlıca katalizörü olmalıdır” 21 Eylül 2017 Perşembe 5
6 1967, Goulian, Kornberg, ve Sinsheimer DNA pol I’in biyolojik olarak aktif DNA sentezi yaptığını göstermişlerdir • X 174 fajı DNAsının (5386 baz, dairesel, tek zincirli) in vitro da tamamının DNA pol I tarafından kopyalandığı • Kopyalanan bu fajın E. coli protoplastlarına aktarıldığında yeni faj partiküllerinin oluşumunu sağladıkları belirlendi 21 Eylül 2017 Perşembe
DNA pol I’in biyolojik rolü halen şüpheli idi • 1969 Delucia ve Cairns- DNA pol I aktivitesine sahip olmayan ancak kendini replike edebilen mutant bir E. coli suşu bulmuştur. Mutasyon pol. A 1 olarak isimlendirilmiştir. • Ancak mutant suş onarım yeteneği bakımdan oldukça yetersizdir. Bu gözlemlerden sonra • Sonuç: 1. E. coli de in vivo replikasyon için en az bir pol daha olmalı 2. DNA pol I in vivo ikincil bir işlevi olmalıdır 21 Eylül 2017 Perşembe 7
DNA polimerazlar ve özellikleri 21 Eylül 2017 Perşembe 8
DNA polimeraz I • 928 aminoasitten oluşan tek zincirli bir polipeptit zinciridir • Aktivite gösterebilmesi için bir kalıp DNA dizisine ve bir serbest 3’ OH ucu taşıyan primere gereksinim duyar • Primerin veya uzamakta olan zincirin 3’-OH ucuna 3’ 5’fosfodiester bağı ile kalıp DNA ya komplementer olan nükleotidi ekler • 5’ 3’ polimeraz aktivitesi yanında 3’ 5’ ve 5’ 3’ ekzonükleaz aktiviteleri gösterir 21 Eylül 2017 Perşembe 9
DNA polimeraz I • 3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesi: • Yok edilecek nükleotidin serbest 3’-OH ucunun bulunması ve bu nükleotidin çift zincirli bir DNA molekülünün parçası olması gereklidir. • Bu şekilde DNA pol I replikasyon sırasında yeni sentezlenen zincire yanlış eklenen bazı polimerizasyon ilerlemeden çıkarır • 5’ 3’ ekzonükleaz aktivitesi: • Kesilen bağın çift sarmal yapıdaki bir DNA bölgesinde bulunması gerekir • Replikasyonda görevini tamamlamış olan primerlerin parçalanması sağlanabilir • DNA molekülünün UV ışınları ile zarar görmüş dimerlerini/diğer mutajenlerin zararlarına karşı hatalı kısımları keserek atabilir 21 Eylül 2017 Perşembe 10
DNA polimeraz I’in Klenow fragmanı DNA polimeraz I’in 5′ 3′ ekzonükleaz domain’i çıkarıldığı zaman geri kalan fragmana Klenow veya büyük fragman denir. Bu fragman polimerizasyon ve proofreading aktivitelerini korur. 11
DNA polimeraz II ve III • DNA pol II ve III enzimleri DNA pol I gibi kalıptan DNA sentezi başlatamaz ve ancak primer adı verilen, var olan bir DNA zincirini kalıp boyunca uzatabilirler. • Her üç enzimin de yeni DNA sentez yönü 5’ 3’ dür. • 3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesi: enzimin polimerizasyonu tek yönde gerçekleştirme, bir an duraksayıp, geri dönerek ilave edilen nt’leri çıkarabilme özelliğidir. DNA pol I gibi, DNA pol II ve III de bu aktiviyeye sahiptir • 5’->3’ ekzonükleaz aktivitesi : DNA pol I özelliğidir. Enzim, sentezin başladığı uçtan itibaren nükleotitleri kesebilir ve sonra sentez yönünde işlemine devam edebilir. Bu nedenle DNA pol I RNA primerini de uzaklaştırabilir. Ortamda pol III den daha fazla bulunur. • DNA pol II-> U. V hasarı nedeniyle oluşan mutasyonların tamirinde rol aldığı düşünülmektedir. • 21 Eylül 2017 Perşembe DNA pol III -> HOLOENZİM-polimerizasyondan asıl sorumlu olan enzimdir. 12
DNA polimeraz’lar ve özellikleri Önemli !! Proofreading yeteneği (Kontrol okuma) proofreading mekanizması olmadan hata oranı (mutasyon oranı) yaklaşık 1 x 10 -6 Proofreading ile hata oranı yaklaşık 1 x 10 -9 21 Eylül 2017 Perşembe 13
Ökaryotlarda DNA polimeraz’lar ve özellikleri DNA polimeraz , δ (delta) ve ε ökaryotik çekirdek DNA’sı replikasyonu için gereklidir. DNA polimeraz ve ζ (zeta) DNA tamirinde rol aldığı düşünülüyor. DNA polimeraz (gama) mt. DNA sentezinde rol alır. 14
Ökaryotlarda DNA polimeraz. III DNA Pol III’ün holoenzim olarak adlandırılan aktif formu, iki takım, 10 farklı polipeptit zincirinden meydana gelmiş bir dimerdir. • M. A 600 k. Da • Core (çekirdek) enzim holoenzimin polimerizasyon aktivitesi gösteren kısmıdır. • kompleks olarak adlandırılan ikinci bölgede 5 alt birim bulunur ve replikasyon çatalında enzimin kalıba oturtulmasında görev alır. • alt birimi, polimerizasyon sırasında enzimin kalıptan kopmamasını sağlar. • (pi), iki çekirdek polimerazın replikasyon çatalında bir aradatutunmasını sağlar. • REPLİZOM Holoezim ve diğer proteinlerin replikasyon çatalında oluşturdukları büyük kompleks. 21 Eylül 2017 Perşembe 1515
DNA Pol III holoenziminin altbirimleri Altbirim Holoenzim Core enzim dimeri 21 Eylül 2017 Perşembe e t d d’ c İşlev 5’ 3’ polimerizasyon aktivitesi 3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesi ve e biraraya gelişi (scaffold) Holoenzimin DNA üzerinde montajı Sürgülü kelepçe = işleme faktörü Kelepçe yükleme kompleksi Kelepçe yükleme kompleksi 16
DNA replikasyonunda görev alan diğer enzimler • DNA primaz: • Replikasyon sırasında RNA polimerazın sentezi başlatabilmesi için serbest 3’-OH grubunu kullandığı 10 -15 nt uzunluğunda RNA primerlerini sentezler • İn vitro da substrat olarak NTP yada d. NTP kullanabilir • DNA ligaz: • Çift zincirli DNA’da 5’P ve 3’-OH grupları arasında fosfodiester bağı oluşmunu katalizler • DNA Helikaz: • Replikasyon çatalına yakın yerden DNA molekülüne bağlanarak , çift zincirli DNA yı ayırır • DNaz: • DNA zincirinde nükleotitler arasındaki fosfodiester bağlarını kırarak DNA yı hidroliz eder. • DNA giraz (Topoizomeraz II): 21 Eylül 2017 Perşembe • Pozitif süperdönümlerin yok edilmesi için DNA omurgasındaki fosfodiester bağlarını önce keser ve sonra kapatır, ATP harcamaz (negatif süperkatlanmalar için ATP harcar). 17
DNA replikasyon modelleri • Yarı korunumlu – semikonservatifreplikasyon modeli • Korunumlukonservatifreplikasyon modeli • Parçalı-dispersifreplikasyon modeli 21 Eylül 2017 Perşembe Bir tur replikasyon Orijinal DNA sonrası a) Yarı korunumlu b) Korunumlu c) Parçalı 18
Yarı korunumlu DNA replikasyonu Watson ve Crick DNA replikasyon mekanizması basamaklarını: a. DNA molekülünün çözülmesi. b. İki zincirin birbirinden ayrılması. c. Her iki zincirinde tamamlayıcısının yapılması. DNA molekülünün birbirinden ayrılarak sentez için her iki zincirinde kalıp görevi yaptığı savunulmaktadır. Böylece replikasyon sonucunda bir zincir korunup diğeri yeniden sentezlenmektedir. Meselson and Stahl deneyi. 21 Eylül 2017 Perşembe 19
Korunumlu replikasyon modeli • Korunumlu replikasyon mekanizmasında DNA molekülünün her iki zinciride korunarak yeni molekülün sentezlendiği savunulmuştur. 21 Eylül 2017 Perşembe 20
Karışık replikasyon modeli • Karışık modelde ise çift zincirli DNA molekülünün parçanabileceği ve bu kısımların replike olduktan sonra tekrar birleşebileceği savunulmaktadır. Böylece replikasyon sonunda mozaik şeklinde bir DNA molekülünün oluşabileceği belirtilmektedir. 21 Eylül 2017 Perşembe 21
Meselson-Stahl deneyi 1. Meselson ve Stahl (1958) E. coli ağır nitrojen izotopunun içinde yani 15 NH 4 Cl şeklindeki 15 N. Bu izotop normal 14 N göre daha yoğun olduğu için Cs. Cl yoğunluk farkı santrifüjünde farklılıklar oluşur. 2. E. coli hücreleri ağır 15 N büyütülüp bütün DNA nın 15 N olduğunun tespitinden sonra, hücreler normal 14 N içeren besi yerine alınmış ve ilk bölünmeden sonra örnek alınarak santrifüj yapılmıştır. 21 Eylül 2017 Perşembe 22
Meselson-Stahl deneyi 3. İlk bölünmeden sonra bütün DNA’lar normal ve ağır karışımı bir yoğunluktadır. İki replikasyon sonrasındaki yoğunluk farkı sentrifujune göre iki farklı bant elde edilmiştir. 4. Önerilen 3 model açısından sonuçlar karşılaştırıldığı zaman: a. Korunumlu modele uymaz çünkü bu modelde ilk bölünmeden sonra iki bant oluşması gerekirdi birisi tamamen 15 N DNA diğeri ise tamamen 14 N DNA olan. b. Karışık modele de uymaz çünkü ikinci bölünmeden sonra 2 bant elde edilmiştir. Oysa bu teoriye göre tek bant olmalı yani 15 N DNA ve 14 N DNA karışık olmalı. c. Yarı korunumlu model bütün sonuçları doğrulamaktadır. 21 Eylül 2017 Perşembe 23
Meselson-Stahl deneyi Başlangıç Cs. Cl E. coli gradientinde kültürleri DNA 15 N içeren besiyeri DNA kompozisyonu DNA bantlarının fotoğrafı Densitometrik tarama Ağır (15 N/15 N) DNA 14 N içeren besiyerinde ilk neslin üremesi Replikasyon döngüsü 2 Ağır, hafif (hibrit 15 N/14 N) DNA üremeye devam Replikasyon döngüsü 3 Hafif (14 N/14 N) DNA Ağır, hafif (15 N/14 N) DNA üremeye devam Replikasyon döngüsü 4 21 Eylül 2017 Perşembe 24
Yarı korunumlu replikasyon için beklenen sonuçlar Nesil 1 Nesil 2 yerçekimi gücü http: //highered. mcgraw-hill. com/olc/dl/120076/bio 22. swf 21 Eylül 2017 Perşembe 25
6 M Cs. Cl içinde DNA Yoğunluk artışı Box Fig. 3. 1 Equilibrium centrifugation of DNA of different densities in a cesium chloride density gradient 50 -60 saat 100. 000 Xg de santrifüj Cs. Cl nin dereceli olarak tabakalanmasını ve DNA bantlaşmasını sağlar 21 Eylül 2017 Perşembe Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings. 26
Ökaryotlarda semikonservatif replikasyon • 1957 yılında Taylor ve arkadaşları Vicia faba kök uçlarını kullanarak doğrulamışlardır. • 3 H-Timidin içeren ortamda • Kolşisin kullanarak kromozom sayısı ikiye katlanmış ve otoradyografiyle kromozomlar görüntülenmiştir. 21 Eylül 2017 Perşembe 27
DNA SENTEZ REAKSİYONU P P CH 2 Baz O CH 2 P Baz O P CH 2 O Baz CH 2 Baz O Sentez reaksiyonu P 5' CH 2 3' OH P P OH P ÜRÜNLER H 20 + 3' P 21 Eylül 2017 Perşembe 5' uç O CH 2 O P Baz OH 3' uç 28
TANIMLAR • Replikasyon orijini: Replikasyonun başlangıç noktası • Replikasyon çatalı: Kromozom üzerinde replikasyonun olduğu noktada sarmala ait zincirlerin açılmasıyla ortaya çıkan bölgedir. Önce sentezin orijin noktasında meydana gelir ve replikasyon devam ettikçe ilerler. Replikasyon çift yönlü ise, orijinden itibaren zıt yöne doğru ilerleyen iki replikasyon çatalı oluşur. • Replikon: bir orijinden bir replikasyon başladıktan sonra replike olan DNA’nın uzunluğunun birim olduğunu belirtmek için kullanılan terimdir. 21 Eylül 2017 Perşembe 29
Replikasyon orijini (prokaryotik): • E. coli’de replikasyon 245 bç uzunluğunda olan ve ori. C olarak adlandırılan tek bir orijinden başlamaktadır. • Bakteri ve bakteriyofajlarda replikasyon tek bir noktadan başladığından kromozomun tümü replikondur. • Replikasyon ori. C’den heri iki yöne doğru hareket eder. Replikasyon ilerledikçe ayrı yönlere doğru birbirlerinden uzaklaşan iki replikasyon çatalı oluşur. Çatallar tüm kromozom replike olduktan sonra ter olarak adlandırılan sonlanma bölgesinde birbiriyle birleşir. ata zincir kardeş zincir replikasyon çatalı replikasyonun sonlanması replikasyon heriki yönde ilerler 21 Eylül 2017 Perşembe 3015
Replikasyon orijini (prokaryotik): • Çift zincirli DNA molekülünün denatüre olarak açılması ve bazların serbest kalması ile başlar. • Replikasyon balonu bubble formunun oluşmasını sağlayan bu işlemden sonra replikasyon iki yönlü olarak devam eder. Orjinde ilk yeni DNA zinciri yapılır Replikasyon orjini dizisi Zıt yönlere doğru giden iki replikasyon çatalının ilerlemesi 21 Eylül 2017 Perşembe Replikasyon çatalı 3115
Replikasyon orijini (ökaryotik): Birden fazla replikasyon çatalı varlığının nedeni: • Ökaryotlarda DNA molekülünün prokaryotlardakine kıyasla çok daha uzun olması 21 Eylül 2017 Perşembe 32 • Ökaryot DNA polimerazların prokaryot enzimleri kadar
Drosophila melanogaster in replike olan DNAsı Replikasyon birimleri (replikonlar) 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 33 Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
E. coli de DNA replikasyonuna katılan proteinler 21 Eylül 2017 Perşembe 34
Prokaryotlarda replikasyonun başlangıcı 1. Replikasyon” replikasyon orjininde başlar ve replikasyon çatalı oluşur, genellikle replikasyon orjinden başlayarak iki yönlü devam eder. E. coli bir replikzayon orjinine (ori. C) sahiptir: a. Başlama için en az 245 bç gereklidir. b. Üç kopya 3 -bç AT-ce zengiz baz dizisi gereklidir. c. Dört kopya 9 bazlık dizi gerekir. 2. a. Başlatıcı protein olan Dna. A (dna. A geni kodlar) bağlanır. b. DNA helikaz (dna. B) Dna. A yı DNA ya bağlar ve enerji kaynağı olarak ATP kullanarak AT ce zengin bölgeyi denatüre eder. c. DNA primaz (dna. G) helikaza bağlanır ve primozomu oluşturur, bu kompleks 5 -10 nt lik RNA primerini sentezler. 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 35
DNA polimerazın DNA yı eşlemesi için öncelikle “RNA primeri” oluşması gerekir DNA polimeraz de novo olarak polimerizasyonu başlatamaz Okazaki ve grubu RNA primerini keşfetmiştir Primozom: RNA primer sentezi için gerekli reaksiyonlara katılan protein kompleksi 21 Eylül 2017 Perşembe 36
DNA replikasyonundaki enzimler Helikaz atasal çift zincirli DNA yı açar Bağlanma proteinleri ayrılmış zincirleri ayrı tutar DNA polimeraz yeni zinciri DNA polimeraz I (ekzonukleaz) RNA oluşturmak üzere primerini keser ve yerine nükleotitleri ekler doğru DNA bazlarını 21 Eylül 2017 Perşembe yerleştirir Primaz kısa primeri (~10 nt) kalıp zincire ekler Ligaz Okazaki Parçalarını birleştirir ve şeker fosfat iskeletindeki diğer kırılmaları yapıştırır. 37
Replikasyon 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Helikaz proteini replikasyon orijini bölgesinden DNA dizisine bağlanır ve DNA zincirlerini ayırır Bağlanma proteinleri ayrılmış zincirlerin tekrar bağlanmasını önler Primaz proteini primer adı verilen ve DNA’ya komplementer kısa RNA dizisini sentezler 21 Eylül 2017 Perşembe 3815
Replikasyon 3’ Replikasyon yönü 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ DNA polimeraz enzimi RNA primerine DNA nükleotitlerini ekler 21 Eylül 2017 Perşembe 39
Replikasyon yönü 3’ 5’ DNA polimeraz enzimi yeni DNA nükleotitlerini RNA primerine ekler. DNA polimeraz eklenen bazları kontrol eder ve yanlış nükleotitleri değiştirir (proofreading-kontrol okuma). 21 Eylül 2017 Perşembe 40
Replikasyon yönü 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Kesiksiz zincir (Leading strand) sentezi 5’ -3’ yönünde devam eder. 21 Eylül 2017 Perşembe 41
Replikasyon 3’ Replikasyon yönü 3’ 5’ 5’ Okazaki fragment 3’ 5’ Kesiksiz sentez 5’ 3’ yönünde devam eder. Kesikli sentez (Discontinuous-lagging strand) Okazaki parçacıkları adı verilen 5’ 3’ yönlü DNA segmentleri üretir. 21 Eylül 2017 Perşembe 42
Replikasyon 3’ Replikasyon yönü 3’ 5’ 5’ Okazaki fragment 3’ 5’ Kesiksiz sentez 5’ 3’ yönünde devam eder. Kesikli sentez (Discontinuous strand) Okazaki parçacıkları Adı verilen 5’ 3’ yönlü DNA segmentleri üretir. 21 Eylül 2017 Perşembe 43
Replikasyon 3’ 5’ 3’ 5’ Kesiksiz sentez 5’ 3’ yönünde devam eder. Kesikli sentez (Discontinuous strand) Okazaki parçacıkları Adı verilen 5’ 3’ yönlü DNA segmentleri üretir. 21 Eylül 2017 Perşembe 44
Replikasyon 3’ 5’ 3’ 5’ Kesiksiz sentez 5’ 3’ yönünde devam eder. Kesikli sentez (Discontinuous strand) Okazaki parçacıkları Adı verilen 5’ 3’ yönlü DNA segmentleri üretir. 21 Eylül 2017 Perşembe 45
Replikasyon 3’ 5’ 3’ 5’ DNA polimeraz I in Ekzonukleaz aktivitesi RNA primerlerini uzaklaştırır. 21 Eylül 2017 Perşembe 46
Replikasyon 3’ 3’ 5’ DNA polimeraz I’in polimeraz aktivitesi boşlukları doldurur. Ligaz şeker fosfat iskeleti arasında bağ oluşturur. 21 Eylül 2017 Perşembe 47
Replikasyon çatalındaki DNA ile birlikte anahtar replikasyon proteinlerinin, «replikasyon makinesi» veya «replizom» modeli 21 Eylül 2017 Perşembe Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
E. coli de replikasyon 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 49 Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
E. coli de replikasyon 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 50 Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
Halkasal DNA moleküllerinde replikasyon • Replikasyon orjinbaşlangıç noktasından başlar ter-bitiş noktasında biter ve iki yönlü devam eder. • Dairesel DNA moleküllerinde iki yönlü devam eden replikasyon teta ( ) yapısı gösterir. Replikasyon çatalının sayısı ve başlama noktasına olan uzaklığı DNA nın uzunluğuna 21 Eylül 2017 Perşembe göre değişir 51
Replikasyon aşamaları • Helikaz ATP hidroliz ederek replikasyon çatalını ilerletir • Oluşan pozitif süperkatlanmalar (süperdönümler) DNA giraz tarafından giderilir • Replikasyon çatalında açılmış tek zincirli DNA bölgeleri (şeker-fosfat iskeleti) SSBP tek zincir bağlama proteinleri ile kaplanarak çift zincir oluşumu engellenir • Bilinen hiçbir DNA polimeraz enzimi kalıp DNA karşısına yeni bir DNA zinciri sentezini başlatamaz • DNA polimeraz bir kalıp DNA dışında serbest 3’-OH grubu taşıyan başlatıcı moleküle-bir primere ihtiyaç duyar • RNA polimeraz enzimi başlatıcı moleküler ve serbest 3’-OH grubuna ihtiyaç duymaz • RNA primaz tek zincirli DNA daki özel dizileri tanır, 6 -7 proteinin oluşturduğu kompleksle etkin işlev gösterir. Bu komplekse «primozom» adı verilir. • 10 -15 nt kısa RNA primer dizisinin kompozisyonunu kalıp DNA daki ribonükleotitler belirler. 10 -15 nt sayısına ulaşınca primer RNA nın 5’-3’ yönündeki sentezi tamamlanır • RNA primerinin 3’-OH ucuna DNA pol. III d. NTP leri eklemeye başlar. 21 Eylül 2017 Perşembe 52
Replikasyon aşamaları • 3’ 5’ yönündeki kalıp DNA zinciri üzerindeki yeni DNA zinciri sentezi RNA primeri ile başlayıp kesintisiz olarak 5’ 3’ yönünde devam ettirilir. • 5’ 3’ yönündeki kalıp DNA zinciri üzerinden yeni DNA zincirinin sentezi yine 5’ 3’ yönünde gerçekleşir. Ancak genel büyüme 3’ 5’ yönünde gerçekleştirilmektedir! • Okazaki ve ark. (1968) • Yeni sentezlenen DNA 1000 -2000 baz uzunluğunda kısa iplikçikler (okazaki parçacıkları) halinde sentezlenmektedir. • Ardından bu DNA parçacıkları birbirine eklenerek uzun zincirler meydana getirirler • Replikasyon çatalında çok kısa süre bulunurlar. Replikasyon devam ederken DNA ligaz tarafından kovalent olarak birbirine bağlanarak yavru zincirleri oluştururlar. 21 Eylül 2017 Perşembe 53
Replike olmamış süperdönümlü atasal DNA zincirlerini ve replike olan kısımları gösteren diyagram Replike olmamış 21 Eylül 2017 Perşembe Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
Halkasal DNA nın replikasyonu ve süperkatlanma sorunu 1. Bazı halkasal kromozomlar (e. g. , E. coli) replikasyon boyunca halkasaldır ve bir tetabenzeri (θ) şekil oluştururlar. Zincir halkanın bir tarafında ayrıldığı için pozitif süperkatlanmalar molekülde oluşur. Replikasyon çatalı saniyede 500 nt ilerler, ve her dönüşte 10 bç olduğundan replikasyon çatalı 3000 rpm döner. 2. Topoizomerazlar süperkatlanmaları açar DNA zincirlerinin ayrılarak replikasyon çatalının hareketine imkan sağlarlar. 21 Eylül 2017 Perşembe
Replikasyon aşamaları • Replikasyonun tamamlanması için halkasal DNA larda iç içe geçen halkanın birbirinden ayrılması için topoizomeraz II benzeri enzimlerin çift zincir kırıkları oluşturması ve çift sarmalları birbiri içinden geçirip kırıkları kapatması gerekir. 21 Eylül 2017 Perşembe 56
Ökaryotlarda replikasyon Prokaryot replikasyonundan daha karmaşık Ancak büyük ölçüde benzer 21 Eylül 2017 Perşembe 57
Ökaryotlarda DNA Replikasyonu 1. Prokaryotlardakine çok benzerdir, yalnızca ökaryotlarda birden fazla kromozom bulunur. 2. Her bir DNA molekülü üzerinde birden fazla ori. E (replikasyon orjini) bulunur (S fazının uzamasını önler) 3. Prokaryotlardaki gibi iki yönlü ve birbirine zıt olarak gerçekleşir 4. Her bir replikasyon çatalında bir kesiksiz bir kesikli DNA sentezi olur 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 58
Replikonlar 1. Ökaryotik kromozomlar prokaryotlara kıyasla daha çok DNA ya sahiptir ve replikasyon çatalları daha yavaş hareket eder, o nedenle tek orjin yeterli değildir. 2. Çok orjinli replikasyon gerçekleşir, replikasyon bir sonraki replikasyon çatalına ulaşıncaya kadar iki yönlü olarak gerçekleşir. Tek bir orjinden replike olan DNA ya replikon ya da replikasyon orjini denir. 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 59
Fig. 3. 12 Replicating DNA of Drosophila melanogaster 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 60 Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
3. Ökaryotlarda replikasyon çatalı prokaryotlardakinden daha küçüktür (100 -200 ntne kıyasla 1000 -2000 nt), replikasyon daha yavaştır, ve her bir kromozom çok sayıda replikon içerir, replikonların büyüklüğü ve sayısı hücre tipine göre değişir. 4. Her orjinde DNA sentezi aynı anda başlamaz -hücreye özgü orijin aktivasyonu. 21 Eylül 2017 Perşembe
Ökaryotik kromozomlarda replikasyon birimlerinde DNA replikasyon başlama olaylarının sıralanışı Zaman Replikasyon birim orjinleri Kalıp DNA (mavi) Yeni DNA (kırmızı) Chapter 3 slide 62 Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
Kromozom sonlarının replikasyonu • Lineer kromozom sonları replike edildiğinde RNA primerleri 5’ uçtan uzaklaştırılınca primer olarak işlev görecek DNA zinciri olmadığından yeni zincirin 5‘ ucunda tek zincirli bölge oluşur. Bu boşluk doldurulmazsa her replikasyon sırasında kromozom kısalacaktır!!! 21 Eylül 2017 Perşembe Chapter 3 slide 63
Ökaryotlarda lineer bir kromozomun uç kısmının replikasyon problemi Çok sayıda replikasyon orjinli ata kromozom Replikasyon sonrası ve yeni DNA RNA primerleri uzaklaştırılır, telomerlerde boşluklar oluşur Boşluk ve Primer uzaklaştırıldıktan sonra oluşan boşluk Chapter 3 slide 64 Peter J. Russell, i. Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc. , publishing as Benjamin Cummings.
Kromozom sonlarının replikasyonu • Çoğu ökaryotik kromozom telomerleri kısa ve türe özgü rastgele tekrarlamalı DNA dizilerine sahiptirler. • 5’ TTGGGG-3’ şeklinde kısa 6 nt lik kısa DNA dizileri birbiri arkasına 20 veya yüzlerce kez tekrarlar oluşturacak şekilde bulunurlar • Telomerik DNA da G bazı açısından zengin kısımlar bulunmaktadır. • Bu G ce zengin bölgeler telomeraz enzimi tarafından tanınır ve DNA molekülünün 3’-OH ucuna eklenir • Telomeraz hem protein hem de kalıp RNA içeren bir enzimdir, tek zincirli olan terminal (uç) telomer tekrarına bağlanır ve boşluğu komplementer bazlarla doldurur • Telomeraz enzimi bu şekilde hücrenin replikasyon aygıtlarını kullanmaksızın telomer tekrarlarını boşluğa ekleyerek kromozom uzunluğunun korunmasını sağlar.
KAYNAKLAR • Modern Moleküler Biyoloji Prof. Dr. Nihat DİLSİZ, Palme Yayıncılık, 2017 • Moleküler Hücre Biyolojisi, Prof. Dr. Hasan Veysi GÜNEŞ , 2014, istanbul Tıp Kitabevi • Moleküler Hücre Biyolojisi, 6. baskıdan çeviri, 2011, Palme Yayıncılık, Çeviri editörleri: Prof. Dr. Hikmet Geçkil, Prof. Dr. Murat Özmen, Prof. Dr. Özfer Yeşilada • Temel Moleküler Biyoloji, 2. baskıdan çeviri, Çeviri Editörü: Prof. Dr. Ali Osman Beldüz, 2014 66
- Slides: 66