MKROBYOLOJDE TEMEL YNTEMLER ONDOKUZ MAYIS NVERSTES ZRAAT FAKLTES
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ GENEL MİKROBİYOLOJİ Hazırlayan: Abdullah EREN 20. 02. 2018
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Hayvanlar ve bitkiler gibi büyük organizmaları çalışan biyologlar , genellikle deneysel materyalleri görebilir, bunların çevrelerinden ve birbirlerinden farklılıklarını ayırt edebilirler. Genellikle görme, koklama, işitme hatta dokunma gibi duyularını kullanarak özellikleri belirler ve ayırt ederler. Böylece, büyüme ve gelişmelerindeki değişiklikler takip edilir. • Mikrobiyologlar, diğer bilim adamlarından farklı olarak görme dışındaki duyuları kullanamadıklarından genellikle belirli problemlere karşıya kalırlar.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Birincisi, mikroorganizmalar çoğu habitatlarda (örneğin, toprak ve ağzımız) karmaşık birliktellikler şeklinde bulunurlar. Bu nedenle , genellikle türleri birbirinden ayırt etmek gerekir. • Mikrobiyologlar mikroorganizmaları çalışma, büyütme, inceleme, ve karakterize etmek için beş temel teknik kullanırlar. Bunlar: inkülasyon, inkübasyon, izolasyon, inpeksiyon ve identifikasyondur. Bu prosedürlerin bazıları veya hepsi, ister yeni başlayan mikrobiyoloji öğrencisi olsun, ister topraktan antibiyotik üreten bakterileri izole etmeye çalışan araştırmacı olsun, isterse bir hastanın enfeksiyonundan alınan bir örnek ile çalışan bir kimlik mikrobiyoloğu olsun bütün mikrobiyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu prosedürler mikroorganizmaların biyolojilerini çalışmak ve kaydetmek için yaygın olarak kullanılırlar.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER 1. İNOKÜLASYON VE İZOLASYON • Mikroorganizmaları çoğaltmak veya kültür yapmak için küçük bir mikroorganizma örneği (inokülüm) besiyeri olarak isimlendierilen içersinde besinler bulunan bir kaba aktarılır. Bu prosedür inokülasyon olarak adlandırılır. Besiyeri üzerinde veya içersinde görülebilir mikrobiyal büyüme kültür adını alır. • Kültür edilen örneğin özelliği analiz amacına bağlıdır. • Saf kültür içerisinde bilinen tek bir tür veya tip mikroorganizmalarının büyüdüğü kültürdür. Laboratuar çalışmaları için genellikle bu tip kültürler kullanılır. Çünkü bu, kontrollü inceleme ve karışık sonuçların oluşmamasına imkan verir. Bazı mikrobiyologlar saf kültür yerine aksenik sözcüğünü kullanmaktadırlar. Bunun manası kültürün çalışılması istenilen organizma dışında başka organizmalar içermemelidir. • Karışık kültür iki veya daha fazla kolaylıkla ayırt edilebilen mikroorganizmaları ihtiva eden kültürdür. • Kontamine olmuş kültür, saf veya karışık kültür oluşurken buna istenmeyen organizmaların girmeleridir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Hüceleri İzole Etme Teknikleri • İzolosyon tekniklerinin esası bir bakterinin diğer bakterilerden ayrılması, besiyeri üzerinde uygun bir yerde bulunması ve koloni olarak isimlendirilen bir kitle oluşturulmasına bağlıdır. Koloni, tek bir hücreden oluştuğundan, tek bir türü içerir ve içerisinde başka organizmalar bulunmaz. Uygun izolosyon az sayıda hücrenin nisbeten geniş sahalı besiyeriye (Petri kabı; şeffaf kapaklı plastik veya cam bir kap) ve inokülasyon özesine ihtiyaç duyulur. . Çizgi ekim metodunda, küçük bir damla kültür veya örnek besiyerinin yüzeyine yayılır. Bu hücreleri seyreltmek ve birbirlerinden ayırmak için özenin farklı bölgeler üzerine sürülmesiyle olur. Etkili ve ekonomik olmasından dolayı, çoğu uygulamalar için en iyi yöntem çizgi ekimdir. • Öze seyreltme veya dökme kap tekniklerinde, örnek seri olarak steril tüp agar besiyerleri içerisine inoküle edilir. Böylece serideki her art arda gelen tüplerdeki hücrelerin sayıları seyreltilmiş olur. İnoküle edilmiş tüpler daha sonra petri kaplarına dökülür ve katılaşması için bekletilir. Sonuç olarak genellikle ikinci ve üçüncü petrilerde hacim başına düşen bakteri sayısı azalmış olur. Böylece hücreler birbirlerinden ayrı koloniler oluşturabilecek yer bulurlar. Bu ve çizgi ekim arasındaki ana farklılık kolonilerin bazıları hemen yüzey yerine besiyerinin içerisinde gelişecektir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER 2. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARLARINDA BESİNLERİN KULLANILMASI • Mikrobiyolojinin gelişmesinin ana sebebi mikropların tabii habitatları dışındaki yerlerde büyütülme tekniklerinin geliştirilmesi ve laboratuarda saf formda geliştirilmeleri olmuştur. Bu gelişmeler mikropların morfoloji, fizyoloji ve genetiklerini yakından inceleme imkanları oluşturmuştur. İlk dönemlerde bile başlarda başarılı kültivasyon için mikroorganizmaların ihtiyaç duydukları bütün besinlerin yapay besiyeri içerisinde bulunması gerektiği tespit edilmiştir. • Mikroorganizmalar besin ihtiyaçları çok basit inorganik bileşiklerden karmaşık organik ve inorganik maddelere kadar çeşitlilik göstermektedir. Hazırlanabilecek besiyerlerin çeşitliliğinde olağan üstü derecede değişmeler olabilir. Örneğin, DIFCO katalogu madern mikrobiyoloji laboratuarlarında kullanılan 500'ün üzerinde besiyeri listelenmektedir. Çoğu moders besiyeri önceden hazırlanmış, ticari olarak toz halinde satılan besiyerilerinden yapılır.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Besiyeri Türleri • Besiyeriler üç temel aşamada sınıflandırılır: (1) fiziksel form, (2) kimyasal kompozisyon, (3) fonksiyonel tip. • Burada tartışılan besiyerilerin çoğu, alg ve bazı protozoalar da içlerinde üreyebilmelerine rağmen bakteri ve funguslar için dizayn edilmişlerdir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Besiyerlerin Fiziksel Özellikleri • Sıvı besiyeri su-ilaveli solüsyonlar olarak tanımlanıp, donma sıcaklığının üstündeki sıcaklıklarda sıvı halde kalan ve şişe veya tüp eğildiği zaman serbestçe boşalabilen besiyerleridir. "Broth, süt, infüzyon" gibi sıvı besiyerler çeşitli maddelerin distil su içerisinde çözülmeleriyle yapılır. Büyüme kültür kabı içerisinde olur ve homojen bulanık bir görüntü oluşturur. Yaygın laboratuar besiyerlerinde olan "nutrient broth" su içerisinde et ekstresi ve pepton'un çözülmesiyle oluşur. "Methylene blue milk" ve "litmus milk" mat renkli sıvılar olup süt ve boya içerirler. Sıvı tiyoglikolat, hafif viskoz özellikte oksijenli ortamda büyüme şeklini belirlemek için kullanılır. • Normal oda sıcaklığında, yarı katı besiyeri pıhtı şeklinde bir görünüm oluşturur. çünkü bu besiyer ihtiva ettikleri sertleştirici madde (agar veya jelatin)'lerden dolayı hefif katılaşır, fakat katı bir substrat oluşturmazlar. Yarı katı besiyerler bakterilerin hareketliliklerini ve bir reaksiyonun belli bir yerde lokalize olmaları için kullanılırlar. Hem hareketlilik test besiyeri hem de SIM düşük miktarda (%0. 3 -0. 5) agar ihtiva eder. Besiyeri dikkatli bir şekilde merkezden iğne ile inoküle edilir ve daha sonra iğne çizgisi etrafındaki büyüme şekline dikkat edilir. SIM, bakteri identifikasyonunda kullanılan fizyolojik özellikleri (hidrojen sülfür üretimi ve indol reaksiyonu) test etmek için kullanılır.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Katı besiyeri hücrelerin üzerinde koloni oluşturabileceği düz bir yüzey sağlayan besiyerilerdir. Katı besiyerler hem bakterilerin hem de fungusların izolasyon ve supkültür edilmeleri için kullanılır. Genellikle eritilebilen ve eritilemeyen olmak üzere ikiye ayrılır. • Eritilebilen katı besiyeriler bazen reverzibıl katı besiyeri olarak adlandırılırlar ve termoplastik (fiziksel özelliği ısı ile değişebilen) bir katılaştırıcı madde ihtiva ederler. Şu ana kadar en yaygın kullanılan ve en etkili alanı agardır. Agar bir kırmızı alg olan Gelidium'dan izole edilen kompleks bir polisakkarittir. Agarın sayısız faydaları vardır. Oda sıcaklığı ve inkübasyon sıcaklıklarında katı olmasına rağmen, suyun kaynama derecesinde (100 C) erir. Agar eridikten sonra, 42 C'ye kadar soğutulmadıkça tekrar katılaşmaz. Bu yüzden, agar sıvı formda (45 -50 C) inoküle edilebilir ve sıvı şekilde dökülebilir. Bu sıcaklık mikroorganizmalara veya elinize bir zarar vermez. Agar elastiki ve şekillendirilebilir besin olarak iş görmelerine rağmen, nem ve besinler için bir tutunma yeri olarak iş görür.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Eritilemeyen katı besiyerileri, termoplastik olmadıklarından agar besiyerinden daha az uygulama yerlerine sahiptirler. Pirinç tanesi (fungusların büyütülmesi için kullanılır), pişmiş et besiyeri (anaeoroplar için kullanılır) ve patates dilimleri gibi materyalleri ihtiva eder. Bu besiyerilerin hepsi de katı olarak başlar ve ısı sterilizasyonu sonrasında da katı kalır. Yumurta ve serum ihtiva eden diğer bazı katı besiyeriler sıvı bir şekilde başlar ve daha sonra katılaşır veya buharlı ısıyla katılaşır.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Besiyerlerin Kimyasal Muhteviyatı • İçeriği kimyasal olarak tanımlanmış besiyerilere sentetik besiyeriler adı verilir. Saf organik ve inorganik bileşikler içeren besiyeriler bir kaynaktan bir başka kaynağa göre çok az farklılık gösterir. Çünkü muhteviyatları özel formülerle belirlenir. Sentetik besiyeriler değişik şekillerde bulunurlar. Örneğin, funguslar için kullanılan minimal besiyeri tuzlar ve suda çözülen amino asitler gibi sadece birkaç esansiyal bileşik içerir. Besiyeri bileşiklerinden tek bir tanesi bile kimyasal olarak tanımlanamıyorsa bu besiyeri bir kopleks ve nonsentetik besiyeridir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Kompleks ve nonsentetik besiyeri, kimyasal bakımdan en az bir tanımlanamayan madde içeren besiyerilerdir. Bu meddelerin çoğu hayvan, bitki veya maya ekstresi olup, hücre doku veya salgılarının öğütülmesi ile oluşturulur. Kan, serum, et ekstresi (infüzyon) bunlara bazı örneklerdir. Diğer sentetik olmayan katı maddeleri ise, süt, maya ekstresi, soya fasülyesi ekstresi ve pepton'dur. Pepton kısmen sindirilmiş protein olup amino asit bakımından oldukça zengindir. Genellikle karbon ve azot kaynağı olarak kullanılır. Nutrient broht, kan agar ve Mac. Conkey agar fonksiyon ve görünüş olarak farklı olmasına ramen, hepsi de sentetik olmayan besiyerilerdir. Kompleks besin ihtiyaçları olan mikroplar için zengin besin karışımı oluştururlar.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Her Amaca Uygun Besiyeriler • Mikrobiyologlar pek çok amaç için kullanılan çeşitli besiyerilere sahiptir. İlave edilen maddeye bağlı olarak, bir mikrobiyolog besiyeriyi her hangi bir amac için modifiye edebilir. • Sonuç olarak, sadece birkaç bakteri ve fungus türü bu tür besiyerilerde yapay olarak kültür edilemez.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Genel Amaç Besiyerleri • Mümkün oldukça fazla geniş spektrumda mikroorganizmanın büyüyebileceği şekilde hazırlanan besiyerilerdir. • Bir kural olarak, bu besiyeriler sentetik değildir ve patojen olmayanların büyümelerini benzer şekilde destekler. • Bu besiyerilere örnek olarak nutrient agar, nutrient broht, brain- heart infüzyon ve tryticase soy agar (TAS)'ı verebiliriz. TAS kısmi parçalanmış süt proteini (kazein), soya fasulyesi ekstresi, Na. Cl ve agar içerir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Zenginleştirilmiş Besiyeri • Kan, serum, hemoglobin veya özel büyüme faktörleri (vitamin, amino asid) gibi özel bir türün büyümesini destekleyen maddeleri içeren besiyerilerdir. Büyüme faktörü veya karmaşık besinlere ihtiyaç olan bakteriler kompleks bakteriler olarak isimlendirilirler. Steril koyun, at veya tavşan kanına agar ilave edilerek hazırlanan kan agar besiyeri Fastidious streptococci ve pek çok diğer patojenleri büyütmek için kullanılmaktadır. Patojenik Neisseria( bir türü bel soğukluğuna sebep olur) Thayer-Martin besiyeri veya kan agarın ısıtılması ile hazırlanan çikolata agar üzerinde büyütülür.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Seçici ve Ayırt Edici Besiyeriler • Zekice hazırlanmış bazı önemli besiyerler seçici ve ayırt edici besiyeriler kategorisine girer. Bir basamakta bir cins hatta bir türün ilk identifikasyonuna imkan sağlanır.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Seçici besiyeriler gaita, tükürük, deri, su ve toprak gibi farklı pek çok türü içeren örneklerden özel bir tip mikroorganizmanın primer izolasyonunda oldukça önemlidir. İzolasyonu istemeyen organizmayı baskılayarak arzu edilen organizmanın büyümesini teşvik ederek yapar. • Monitol salt agar (MSA) %7. 5'lik Na. Cl içerir. Bu konsantrasyondaki tuz Staphylococcus cinsi hariç çoğu insan patojenlerinin büyümelerini engeller. Staphylococcus bu besiyeriüzerinde iyi bir şekilde büyür, bu yüzden oldukça karışık örnekler içerisinden seçilerek çoğaltılır. Façes bileşiklerinden olan "bile salt"ları pek çok gram olumlu bakterinin büyümesini engellerken gram olumsuz çomak şekilli bakterilerin büyümelerine izin verir. Bağırsak patojenlerinin izolasyonu için kullanılan besiyeriler (Mac. Conkey agar, eozinmetilen blue ( EMB ) seçici madde olarak "bile tuz" içerirler. Metilen mavisi ve kristal violet gibi boyalar aynı zamanda gram-olumlu bakterilerin büyümesini engellerler. Selenit ve brillant yeşil boyası façesten salmonella izolasyonu için, sodyum asid ise su ve besinlerde enterokokküsleri izole etmek için kullanılır.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Farklılaştırıcı besiyeriler, çeşitli mikroorganizmaların büyümelerini sağlarken, bu mikroorganizmaların görünür farklılıklarını ortaya çıkarır. Ayırt etme koloni büyüklüğü ve rengi, besiyeri renginin değişmesinde ve gaz kabarcıkları ve çözeltilerin oluşması şeklinde görülür. Bu değişiklikler besiyerilerinin içeriği maddelerden ve mikroorganizmaların bu maddeler ile olan ilişkilerinden kaynaklanır. Örneğin, bir madde X organizması tarafından kulanılıyor. Y organizması tarafından kullanılmıyor olsun. Böylece X organizması besiyeride gözlenebilir değişiklik oluştururken, Y organizması değişiklik oluşturmaz. En basit ayırt edici besiyeri, özel bir maddenin kullanılması ile iki farklı reaksiyon gösterir. Bazı besiyeriler ise üç veya daha fazla reaksiyon gösterebilir (örneğin TSIA, triple-sugar iron agar). • Boyaların pek çoğu p. H indikatörleri olduklarından ve asid ve baz üretimine karşı renk değişiklikleri oluşturduklarından ayırt edici madde olarak kullanılır. Örneğin, Mac. Conkey agar nötral durumlarda sarı, asidik durumlarda ise pembe veya kırmızı renk oluşturan nötral kırmızı boyası ihtiva eder.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER Muhtelif Amaçlı Besiyeriler besiyeriler, oksijeni absorplayan veya besiyeri • İndirgeyici oksijeninin peretrasyonunu yavaşlatan bir madde (thioglycollic asit veya sistein) içeren veya oksijen ihtiyacının test edilmesi için kullanılır. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri fermentlenebilecek (asitlere dönüşebilecek) şekerler ve bu reaksiyonu gösteren bir p. H indikatörü içeren besiyerileridir. • Taşıma besiyerileri, örneklerin klinik analizlerinden önce özellikleri bozulmadan muhafaza edildikleri veya taşındıkları besiyerilerdir. Stuarts ve Amies taşıma besiyerleri tuzlar, tamponlar ve absorbantlar içerir. Bunlar hücrelerin enzimler, p. H değişmeleri, toksik materyaller tarafından tahrip olmalarını önler, fakat büyümeyi desteklemez. • Test besirerileri antimikrobiyal maddelerin etkilerini test etmek, dezenfektant, antisepsis, kozmetik ve mikroorganizmalardan koruyucu maddelerin etkilerini belirlemek için kullanılan besiyerilerdir. • Sayım besiyerileri süt, su, besin, toprak ve diğer örneklerdeki mikroorganizmaların sayısını belirlemek için endüstri veya çevre mikroorganizmaları tarafından kullanılan besiyerilerdir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER 3. İNKÜBASYON, İNSPEKSİYON VE İDENTİFİKASYON • Besiyeri kabı inoküle edildikten sonra inkübe edilir. Bunun manası ısısı kontrol edilen bir sistem veya inkübatör içerisine yerleştirilerek büyüme teşvik edilir ve kültür olur. Mikroorganizmalar donma ve kaynama noktaları arasındaki sıcaklıklarda büyümeye adapte olmalarına rağmen, lab. çalışmalarında genellikle kullanlıan sıcaklıklar 20° ile 40°C arasına düşer. • İnkübatorlar, aynı zamanda bazı organizmaların büyümeleri için ihtiyaç duydukları karbondioksit ve oksijen gibi atmosferik gazların oranlarını da kontrol edebilir. • İnkübasyon döneminde (bir günden birkaç hafta arasında değişir) mikroorganizma büyüyerek gözle görülebilirhal alır, sıvı besiyeride bir bulanıklık oluşturur.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER • Mikroorganizmalar inkübasyonun çeşitli safhalarında mikroskobik olarak incelenebilirler. Bir sıvı besiyerdeki mikrobiyal büyüme bulanıklık, sediment, yüzeyde birikinti oluşumu veya renk ile belirlenir. Katı besiyeriler üzerinde görünen yaygın büyüme şekli, özellikle bakteri ve funguslardaki kolonilerin görünmesidir. • İzolasyon birkez olduktan sonra, izole olmuş bir koloniden çok az bir miktarda alınarak (öze ile dokunarak) içerisinde besiyeri olan bir kültür kabına inoküle edilir. Böylece ikinci seviyede kültür oluşturulur. Bu işleme subkültür adı verilir.
MİKROBİYOLOJİDE TEMEL YÖNTEMLER TEŞEKKÜRLER • KAYNAK
SORULAR • Muhtelif amaçlı besiyerilere örnek vererek birini açıklayınız ? • Mikrobiyologların mikroorganizmalar üzerinde çalıştıkları prosedürlere örnek vererek bir tanesini açıklayınız ? • Besiyeri türlerinin 3 temel aşaması nedir ? Aşamaların bir tanesinden örnek veriniz ? • Besiyeri kabı inoküle edildikten sonra ………… edilir. Bunun manası ısısı kontrol edilen bir sistem veya ………… içerisine yerleştirilerek büyüme teşvik edilir ve …………. olur. • Mikroorganizmaları çoğaltmak veya ………. . . . için küçük bir mikroorganizma örneği …………………. . olarak isimlendierilen içersinde besinler bulunan bir kaba aktarılır. Bu prosedür ……………. . olarak adlandırılır. Besiyeri üzerinde veya içersinde görülebilir mikrobiyal büyüme …………adını alır.
- Slides: 29