Miten tutkin B 12 vitamiinin ja foolihapon puutosta

Miten tutkin B 12 vitamiinin ja foolihapon puutosta? Yleislääkäripäivät Helsinki 27. 11. 2014 Saila Loikas LT, kliinisen kemian erikoislääkäri TYKSLAB, hematologian toimiala

B 12 vitamiinin puutteen historiaa • 1800 luku: näivetysveritauti, pernisiöösi anemia, kuolemaan johtava anemia • 1920 luku: runsas maksansyönti korjaa anemiaa • 1930 luku: tarvitaan lihasta peräisin olevaa ulkoista tekijää (B 12 vitamiini ) ja mahasta peräisin olevaa sisäistä tekijää • 1990 luku: harvinainen, matala kokonais B 12, megaloblastinen anemia

B 12 vitamiinin puute 2000 luvulla • Yleistä iäkkäillä (prevalenssi yli 10%) • Hoitamaton B 12 vitamiinin puute johtaa palautumattomiin vaurioihin • Hoito on helppo, diagnostiikka vaikeaa – Ei yksimielisyyttä määritelmästä – Ei ”kultaista standardia” diagnostiikassa – Oireiden epäspesifisyys ja ongelmat laboratoriotutkimusten valinnassa ja tulkinnassa johtavat helposti joko diagnoosin viivästymiseen tai ylidiagnostiikkaan

B 12 vitamiini eli kobalamiini • Rakenne: porfyriinirengas, jonka keskellä kobolttiatomi ja siihen liittyy puriininukleotidi ja orgaaninen sivuketju (deoksiadenosyyli tai metyyli , hydroksi , syano) • Bakteerit syntetisoivat • Saadaan ravinnosta, eläinkunnan tuotteista. • Länsimainen ravinto sisältää n. 5 30 µg/vrk. • Päivittäinen tarve 2 µg/vrk

B 12 vitamiinia vaativat reaktiot Metyylimalonaatti Amino- ja rasvahappojen katabolia Kuva modifioitu (Kouri) Nielsen et al. , 2012

B 12 vitamiinin kuljettajaproteiinit • Intrinsic Factor, sisäinen tekijä (IF) synteesi mahan limakalvon parietaalisoluissa B 12: n kuljetus ohutsuolesta enterosyyttiin • Haptokorriini (HC) suurin osa kokonais B 12: sta haptokorriiniin sitoutunutta B 12 varastot? • Transkobalamiini (TC) B 12: n kuljetus verestä DNA: ta syntetisoiviin soluihin n. 6 20 % kokonais B 12: sta transkoblamiinin sitoutunutta, biologisesti aktiivinen osa B 12: sta aktiivisen B 12 vitamiinin puoliintumisaika plasmassa lyhyt

B 12 vitamiinin imeytyminen

B 12 vitamiinin puutteen etiologia 1 Malabsorptio – Pernisiöösi anemia, autoimmuunigastriitti, noin 20% – Proteiiniin sitoutuneen B 12 -vitamiinin malabsorptio, tavall. Hpgastriitin jälkeen hapon ja pepsiinin eritys alentunut, noin 70% – Gastrektomia – Ileumin sairaudet tai resektio – Haiman vajaatoiminta – Lääkkeen indusoima (PPI-lääkkeet, metformiini, ilokaasu) – Kongenitaalinen IF-puutos tai dysfunktio – Imerslund-Gräsbeckin syndrooma (cubam-reseptorin geneettinen häiriö)

B 12 vitamiinin puutteen etiologia 2 • • • Biologinen kilpailu B 12 -vitamiinista – Suolen bakteerien liikakasvu – Lapamato Ravitsemukselliset syyt, noin 4% – Vegaanit – Aliravitsemus Heikentynyt vitamiinin hyväksikäyttö – Kongenitaalinen transkobalamiinin puutos

B 12 puutteen oireita ja löydöksiä • Hematologiset – makrosytoosi – anemia – neutropenia (infektioherkkyys) – trombosytopenia (mustelmataipumus) – megaloblastinen luuydin – Intramedullaarinen hemolyysi (P LD , P Bil , P Haptog ) • Muut – kielikipu, suun limakalvomuutokset – infertiliteetti • Neurologiset – perifeerinen polyneuropatia – myelopatia (asento- ja vibraatiotunnon häiriöt, klassinen subakuutti kombinoitu degeneraatio, johtaa ataksiaan) – autonomisen hermoston häiriöt – muistihäiriöt – dementia • Psykiatriset – ärtyneisyys, persoonallisuusmuutokset – depressio – sekavuus – psykoosi

B 12 puutteen neurologiset oireet • Neurologiset oireet edeltävät usein vitamiinipuutoksen hematologisia löydöksiä • Neurologiset oireet voivat jäädä pysyviksi

B 12 puutteen diagnostiikka, ongelmia • Keitä tutkitaan? – makrosytoosi, anemia? – neurologiset oireet? – muut oireet? – riskiryhmien seulonta? (kaikki yli 65 v? , vegaanit? ) • Miten tutkitaan? – pvk, veren sivelyvalmiste, luuydin? – kokonais B 12 (S B 12 vit)? – aktiivinen B 12? – metaboliitit Hcyst ja metyylimalonaatti?

Liedon iäkkäät tutkimus • Yhteistyössä Yleislääketiede, Turun Yliopisto + TYKS Laboratoriot + Härkätien Terveyskeskus (Sirkka Liisa Kivelä, Raimo Isoaho, Minna Löppönen, Kerttu Irjala) • 65 vuotta täyttäneen väestön kliinisepidemiologinen tutkimus • Liedossa 1998 asukkaita 13 000, 11% iäkkäitä (>65 vuotta) • Toinen aineiston keruu 3/1998 12/1999 • Kutsuttu kaikki kunnassa asuvat, vuonna 1933 tai aiemmin syntyneet, n=1596, osallistui 1260 (82%) • Tutkittavat kävivät lääkärintarkastuksessa, ja heistä on käytettävissä runsaasti laboratoriotutkimuksia sekä tiedot sairauksista, ruokavaliosta, lääkkeiden ja vitamiinivalmisteiden käytöstä, dementiaseula ja depressiokysely

B 12 vitamiinin puutteen yleisyys? • B 12 vitamiinin puutteen esiintyvyys suomalaisessa yli 65 vuotiaasta väestössä on 12 % • Kokonais B 12 vitamiinin pitoisuus oli matala (< 150 pmol/l) 6%: lla. • Diagnosoimaton B 12 vitamiinin puute on yleistä; 78 %: lla potilaista diagnoosi ei ollut tiedossa. Loikas S, Koskinen P, Irjala K, Löppönen M, Isoaho R, Kivelä S L, Pelliniemi T T. Vitamin B 12 deficiency in the aged: a population based study. Ageing. 2007 Mar; 36(2): 177 83.

B 12 vitamiinin puutteen riskiryhmät? • Kasvisruokavaliota käyttävät (erityisesti raskaana olevat ja imettävät) • Mahdollinen imeytymishäiriö (atrofinen gastriitti, krooniset suolisto sairaudet, PPI lääkkeitä tai metformiinia käyttävät, autoimmuunitaudit jne. ) • Iäkkäät – oma tutkimus, 1048 yli 65 vuotiasta – miessukupuoli, ikä yli 75 v ja maitotuotteiden välttäminen kaksinkertaistivat B 12 puutten todennäköisyyden – B 12 puutetta ei voinut ennustaa elintapojen, todettujen sairauksien tai käytössä olevien lääkkeiden perusteella Loikas S, Koskinen P, Irjala K, Löppönen M, Isoaho R, Kivelä S L, Pelliniemi T T. Vitamin B 12 deficiency in the aged: a population based study. Ageing. 2007 Mar; 36(2): 177 83.

Kun B 12: n imeytyminen loppuu. . . serum depletion: aktiivisen B 12: n pitoisuus pienenee cell depletion: B 12 soluissa pienenee biokemiallinen puute: DNA synteesi vähenee, metaboliitteja kertyy (metyylimalonaatti, homokysteiini) kliininen puute: anemia, neurologiset oireet, palautumattomat muutokset (kokonais B 12 pienenee)

B 12 puutteen dg: hematologia? • • Perinteisesti hematologinen ongelma, makrosyyttianemia (Hb , MCV ) Veren sively: makro ovalosyytit, yliliuskoittuneet neutrofiilit, luuydin megaloblastinen Intramedullaarinen hemolyysi P LD Folaatin puute aiheuttaa samanlaiset muutokset Neurologiset vauriot usein ennen hematologisia muutoksia! Oma tutkimus: vain 2/97 B 12 -puutteista olisi löytynyt, jos olisi tutkittu vain makrosyyttianemia-potilaat! Oma tutkimus: anemia tai makrosytoosi eivät ennustaneet B 12 puutetta Loikas S, Koskinen P, Irjala K, Löppönen M, Isoaho R, Kivelä SL, Pelliniemi TT. Vitamin B 12 deficiency in the aged: a population based study. Ageing. 2007; 36: 177 83. Epub 2006 Dec 21. Loikas et al. Clinical signs and symptoms in the aged with low total vitamin B 12 concentrations. Submitted.

B 12 puutteen dg: hematologia • Hb ja MVC – normaali Hb ja MCV ei poissulje B 12 puutetta – makrosytoosin pitää herättää epäily B 12 puutteesta • Veren sively – voi auttaa makrosytoosin erotusdiagnostiikassa • Luuydintutkimus – ei rutiinisti, voidaan tarvita makrosytoosin erotusdignostiikassa

B 12 puutteen dg: kokonais B 12? • Tuttu ja halpa tutkimus, helposti saatavilla • Sensitiivisyys huono: kokonais B 12 ei kuvasta biologisesti aktiivisen B 12: n määrää palautumattomia vaurioita voi tulla jo ennen kuin kokonais B 12 on matala – Väärät matalat esim. raskaus, e pillerit, myelooma, folaatin puute, B 12 kantajaproteiininen puutokset – Väärät korkeat esim. munuaisten vajaatoiminta, maksasairaudet, krooniset myeloproliferatiiviset sairaudet – Pernisiöösi anemia potilaan IF vasta aineet korkeina pitoisuuksina voivat aiheuttaa vääriä korkeita B 12 tuloksia

B 12 puutteen dg: kokonais B 12 • Alentunut kokonais B 12 (alle viitealarajan, noin <150 pmol/L) oireisella potilaalla oikeuttaa B 12 hoidon • Normaali kokonais B 12 (>250 pmol/l) poissulkee B 12 puutteen ? ? • Jos kokonais-B 12 on 150 -250, tarvitaan jatkotutkimuksia B 12 puutteen poissulkemiseksi tai varmistamiseksi – näitä potilaita on noin kolmannes kaikista

B 12 puutteen dg: homokysteiini? • B 12 vitamiinin puutteessa Hcyst: n remetylaatio metioniiniksi estyy P Hcyst • Herkkä, mutta epäspesifinen – – – näytteen otto ja käsittely folaatin puute munuaisten vajaatoiminta autoimmuunitaudit, syövät… elintavat (kahvi, tupakka…) lääkkeet • Hyperhomokysteinemia, kansainvälinen suositus – aikuiset >15 umol/l – yli 65 v >20 umol/l

B 12 puutteen dg: metyylimalonaatti? • B 12 vitamiinin puutteessa metyylimalonaatin muuttuminen suc Co. A: ksi estyy S metyylimalonaatti • Herkkä ja spesifinen • Munuaisten vajaatoiminta nostaa • Ei hyvää rutiinikäyttöön soveltuvaa menetelmää: GC/MS (vaikea&hidas kallis) • Ei tehdä Suomessa, ulkomailta hankittuna tuloksen saa n. kahdessa viikossa

Aktiivinen B 12 vitamiini • Transkobalamiini nimiseen kuljettajaproteiiniin sitoutunut B 12 vitamiini, n. 6 20 % kokonais B 12: sta • Biologisesti aktiivinen osa B 12: sta, B 12: n kuljetus verestä DNA: ta syntetisoiviin soluihin • Varhaisin B 12 vitamiinin puutteen osoittaja?

Aktiivinen B 12 vitamiini • Monia määritysmenetelmiä kuvattu jo lähes 30 vuotta sitten, ensimmäinen immunologinen v 2000 (Holo. TC RIA, Axis Shield) • Nyt automatisoidut immunologiset menetelmät (MEIA ja CMIA) – mikropartikkeli entsyymi immunomääritys, MEIA Abbott Ax. SYM – immunokemiluminometrinen, CMIA (Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay) Abbott ARCHITECT – mikropartikkeleissa B 12 TC spesifinen vasta aine, detektio TC vasta aineella • Tutkimus ollut Suomessa rutiinikäytössä helmikuusta 2005 • Tällä hetkellä ainakin 5 laboratoriota Suomessa tekee, kaikkien saatavilla!

Architect aktiivisen B 12 vitamiinin (S B 12 TC 2) määritys B 12 2 B 12 + B 12 B 12 WASH 2 B 1 Active B 12 specific MAb (mouse, monocl. ) immobilised on paramagnetic microparticle. Sample B 12 bound to transcobalamin (red) and haptocorrin (magenta). VAIN aktiivinen B 12 sitoutuu kiinteään faasiin acridinium B 12 Anti TC: acridinium conjugate (mouse, moncl. ) is added. Timo Kouri 21. 2. 2013 Conjugate binds to TC bound to solid phase. + WASH Unbound conjugate is removed. basic p. H + peroxide light Rate of chemiluminescence is directly proportional to [Active B 12] in sample.

Aktiivinen B 12 vitamiini • Kuntaliiton tutkimusnumero 1142 • Tutkimuslyhenne S B 12 TC 2 • Pitkiä tutkimusnimikkeitä käytetään eri laboratorioissa vielä vaihtelevsti: S aktiivinen B 12 vitamiini tai S B 12 vitamiini, transkobalamiini II: een sitoutunut. • Kansainvälisessä kirjallisuudessa käytössä on pääasiassa nimi holotranskobalamiini.

Aktiivisen B 12 vitamiinin käyttökelpoisuus B 12 puutteessa Viite Aineisto Tulos Herzlich & Herbert Lab Invest 1988 N=28: B 12 puute 5, PA 7, kontr 16 Holo. TC matala B 12 puutteessa. + Lindgren et al. Eur J Clin Invest 1999 N=101 Holo. TC: lla parempi korrelaatio B 12 malabsorptioon kuin B 12: lla + Nexø et al. Clin Chem 2002 N=88 B 12/placebo Holo. TC on varhainen B 12 puutteen + markkeri Lloyd Wright et al. Clin Chem 2003 N=172 vegaanimiestä Holo. TC voi korvata B 12+ metaboliittimääritykset + Nilsson et al. Clin Chem Lab Med. 2004 N=209 psykogeriatrista potilasta ja 48 kontrollia Matala Holo. TC ei ole spesifinen B 12 puutteelle - Chen et al. Am J Clin Nutr. 2005 29 PA –potilasta ja 33 kontrollia Metabolinen B 12 status on pääasiallinen holo. TC pitoisuuden determinantti. Holo. TC ei ole käyttökelpoinen B 12 malabsorption mittarina. + Hvas & Nexø J Intern Med 2005 N=140 MMA , B 12/placebo injektiot Holo. TC lupaava varhaisen B 12 puutteen testi. +

Aktiivisen B 12: n ja kokonais B 12: n vertailu, julkaistut (ROC) analyysit. + Aktiivinen B 12 parempi kuin kokonais B 12 = Aktiivisella ja kokonais B 12: lla ei eroa Viite N Aineisto Herrmann ja Obeid Eur J Clin Invest 2013 Heil ym. Ann Clin Biochem 2012 Valente ym. Clin Chem 2011 Schremp ym. J Neurol 2011 Clarke ym. Clin Chem 2007 Obeid ja Herrmann Clin Chem Lab Med 2007 Miller ym. Clin Chem 2006 Hvas ja Nexo J Intern Med 2005 Lloyd-Wright ym. 1034 B 12 -pyynnöt , ikä 25 – 83 v B 12 -puutteen määritelmä MMA > 0, 30 μmol/l 360 B 12 -pyynnöt, ikä ka 59, (19 – 100) MMA > 0, 45 μmol/l + 700 Iäkkäät, ka 81(69 – 92) + 851 Neuropsyk. potilaat, ikä 66 (18 – 98) Punasolujen B 12 vitamiini 33 pmol/l MMA > 0, 40 μmol/l 2403 Iäkkäät, ikä 79 (75 – 83) + 1018 B 12 -pyynnöt, ikä ka 58 MMA > 0, 45 ja >0, 75 μmol/l MMA > 0, 30 μmol/l 607 Iäkkäät, ikä 70 (60 – 101) = 806 B 12 -puutteen epäily, ikä 72 (19 – 102) 195 Vegaanimiehiä ja kontr ikä (18 – 78) MMA > 0. 35 μmol/l ja Hcyst > 13 μmol/l MMA > 0. 75 μmol/l ja Hcyst > 15 μmol/l MMA >0, 27 μmol/l + Clin Chem 2003 Herrmann ym. 204 Clin Chem Lab Med 2003 Kasvissyöjiä ja kontr, ikä ka 40/46 (21 – 73) Johtopäätös + = + + =

B 12 vitamiinimääritysten tarkkuus, kun verrataan metyylimalonaattiin (S Met. Mal > 300 nmol/l) aktiivinen B 12 Ax. CYM Harmaa dg alue 22 76 pmol/l Se 90%, Sp 27% katkoviiva = kokonais B 12 vitamiini yhtenäinen viiva = aktiivinen B 12 vitamiini AUC = 0. 71 Se 72%, Sp 54% Se 21%, Sp 90% Timo Kouri 21. 2. 2013 Herrmann W ja Obeid R, Eur J Clin Invest 2013; 43: 231 7

S B 12 Vit vs. S B 12 TC 2 potilailla, saman päivän tutkimukset (n=300) +/ 15 pmol/l S –B 12 Vit 540 pmol/l 250 pmol/l 140 pmol/l Timo Kouri 21. 2. 2013 S –B 12 TC 2 35 pmol/l

Suositus B 12 -vitamiinin puutteen toteamiseksi HUSLAB 4. 4. 2013 HUSLAB: Kouri T, Paju A, Alitalo R, HUS hematologia: Ebeling F • Aktiivisen B 12 -vitamiinin määritystä (S –B 12 -TC 2) suositellaan ensisijaiseksi B 12 vitamiinin puutteen tutkimukseksi • Jos S-B 12 -TC 2 -pitoisuus on alle 20 pmol/l, hoitopäätös voidaan tehdä • Jos S-B 12 -TC 2 -pitoisuus on yli 50 pmol/l, ei puutetta • Väliin jäävällä harmaalla alueella – B 12 hoitokoe tai homokysteiini (P –Hcyst) tai metyylimalonaatti (S Met. Mal). Metaboliittien suurentunut pitoisuus viittaa B 12 puutteeseen. tai kontrolloi aktiivinen B 12 n. 2 3 kk kuluttua

B 12 puutteen laboratoriotutkimukset ja munuaisten vajaatoiminta • Sekä B 12 vitamiinin puute että munuaisten vajaatoiminta lisääntyvät iän myötä • Lieväkin munuaisten vajaatoiminta nostaa homokysteiinin ja metyylimalonaatin pitoisuuksia • Vaikeassa munuaisten vajaatoiminnassa kokonais B 12 ja aktiivinen B 12 saattavat suurentua • Oma tutkimus, 1011 yli 65 v: munuaismarkkerit kystatiini C ja krea korreloivat voimakkaasti t. Hcy: n ja MMA: n kanssa, mutta eivät kokonais B 12: n tai aktiivisen B 12: n kanssa Loikas S et al. Renal impairment compromises the use of total homocysteine and methylmalonic acid but not total vitamin B(12) and holotranscobalamin in screening for vitamin B(12) deficiency in the aged. Clin Chem Lab Med. 2007; 45(2): 197 201.

Folaatti • saadaan ravinnosta, maksa, hiiva, vihreät kasvikset, täysjyvävilja, maitotuotteet • länsimainen ruokavalio sisältää noin 250 µg/vrk. Folaatti tuhoutuu helposti kuumennettaessa. • minimitarve on noin 50 µg päivässä ja suositeltu ravinnon päivittäinen määrä on noin 3 µg/painokilo. – tarve lisääntyy raskauden (päivittäinen tarve noin 500 µg) ja imetyksen (päivittäinen tarve noin 350 µg) aikana. • imeytyy ohutsuolen alkuosassa, siirtyy plasmasta kudoksiin spesifisen reseptorin välityksellä. • Solunsisäinen folaatti on mobilisoitavissa ainoastaan maksasta. Maksan folaatin käyttöönotto tapahtuu enterohepaattisen kierron kautta. Varastot riittävät vain noin 3– 4 kuukauden tarpeeseen. • erittyy virtsan, hien ja ihon hilseilyn mukana.

Folaatin puutteen etiologia • riittämätön saanti yksipuolisen ravinnon seurauksena – aliravitsemus, psyykkiset sairaudet, alkoholismi • imeytymishäiriö – keliakia, Crohnin tauti, laajat suoliston resektiot • lisääntynyt tarve – raskaus, imetys, – nopeutunut solunjakautuminen: krooniset hemolyyttiset anemiat, pahanlaatuiset veritaudit, syöpätaudit tai tulehdukselliset sairaudet • vähentynyt varastoituminen – aktiivinen maksasairaus, sydämen vajaatoiminta • lisääntynyt eritys – virtsaan: aktiivinen maksasairaus, sydämen vajaatoiminta – ihon hilseilevät sairaudet • megaloblastinen tila voi kehittyä nopeasti, koska elimistön folaattivarastot ovat pienet

Folaatin puute alkoholisteilla • usean eri mekanismin samanaikainen vaikutus – riittämätön saanti ravinnosta – vähentynyt imeytyminen – enterohepaattisen kierron estyminen – lisääntynyt erittyminen virtsaan

Lääkkeiden aiheuttama foolihapon puute • dihydrofoolihapporeduktaasin esto – Metotreksaatti (haittavaikutuksia vähennetään antamalla foolihapon aktiivista metaboliittia, foliinihappoa) – Trimetopriimi suurina annoksina tai jos potilaan folaattivarastot ovat pienet – Triamtereeni suurina annoksina i voi aiheuttaa vaikeana trombosytopeniana ilmenevän megaloblastisen tilan etenkin sydämen vajatoimintaa sairastaville vanhuksille, joilla on muitakin folaatin puutteelle altistavia muutoksia. • epilepsialääkkeet (karbamatsepiini, fenytoiini, lamotrigiini, primidoni, valproiinihappo ja fenobarbitaali) voivat aiheuttaa folaatin imeytymisen vähentymistä tai maksan entsyymi induktion kautta folaatin aineenvaihdunnan lisääntymistä

Folaatin puutteen laboratoriotutkimukset • Seerumin folaatti (f. S Folaat) – pieneneminen on varhaisin muutos folaatin puutteessa, mutta ei aina merkitse folaattivarastojen folaattipitoisuuden vähyyttä – laskee jo muutamissa päivissä tilapäisen niukasti foolihappoa sisältävän ruokavalion jälkeen • Punasolujen folaatti (f. E-Folaat) – kuvastaa elimistön folaattivarastojen määrää paremmin – hidas muuttuja, koska folaatti kertyy punasoluun sen syntyessä ja punasolun pitkän eliniän takia heijastaa folaattitasapainoa useamman kuukauden ajalta ennen näytteenottoa. • Jos folaatin puute kehittyy nopeasti esimerkiksi raskauden tai parenteraalisen ravitsemuksen aikana, voi punasolujen folaattipitoisuus olla viitealueella elimistön folaatin puutteesta huolimatta.

Folaatin puutteen laboratoriotutkimukset • Koska folaatin kertyminen punasoluihin on B 12 vitamiinista riippuvaa, voi punasolujen folaattipitoisuus olla matala (ja plasman folaattipitoisuus korkea) B 12 vitamiinin puutteessa • Väärä normaali seerumin folaattipitoisuus – intravaskulaarinen hemolyysi – puutteellinen ruokavalio on korjaantunut muutamia päiviä ennen näytteenottoa • Väärä normaali punasolujen folaattipitoisuus – punasolusiirtojen jälkeen – voimakkaassa retikulosytoosissa (retikulosyyttien folaattipitoisuus on korkeampi kuin kypsien punasolujen)

Yhteenveto • B 12 vitamiinin puutteen laboratoriotutkimus on aktiivinen B 12 -vitamiini – Hoito, jos alle 20 pmol/l – Kontrolli, hoitokoe tai Hcyst, jos 20 -50 pmol/l • Folaatin puutteen laboratoriotutkimus on punasolujen folaatti – Hoito, jos alle viitealarajan