Mikroskopet Hvad er en forstrrelse Hvad er lys

Mikroskopet Hvad er en forstørrelse? Hvad er lys? Forstørrelsen er et tal, der fortæller hvor mange gange større en ting (f. eks. en celle) vises på et billede Lys er elektromagnetisk stråling og kan beskrives både som bølger og som partikler (fotoner) Hvordan udtrykkes det i FG? “Forstørrelse udtrykkes ved forholdet mellem billedstørrelse og objektstørrelse i lineært mål” Hvad har en lysbølge? Hvad er opløsningsevne? “Opløsningsevnen er den mindste afstand 2 objektpunkter må have fra hinanden, når de endnu skal kunne ses adskilt” En lysbølge har en bølgelængde og en amplitude Hvad fortæller det? Opløsningsevnen (d) fortæller hvor små ting man kan se med mikroskopet Amplitude Hvordan er opløsningsevnen defineret? Bølgelængde Hvordan ser vi dem? Og n og u er? u: “den halve topvinkel i den lyskegle der opfanges af objektivet” og n: brydningsindekset mellem dækglas og mediet mellem dækglas og objektiv Den optimale opl. evne fås når… bølgelængden er lille og NA er stor Topvinklen stor, og der kommer mere lys ind i objektivet fra hvert punkt Når NA er stor er … Dem ser vi som henholdsvis farve og intensitet. Hvad er fotoner? Fotoner er lysklumper Hvad har en foton? En bestemt bølgelængde(farve) Hvad bestemmer farven og intensiteten? Mængden og bølgelængden af fotoner fra en lyskilde

Hvad er den maksimale opløsningsevne for lysmikroskopi? d=0. 2 mikrometer, da NA = 1. 51* sin(90 o) = 1. 51*1 = 1. 51 og da bølgelængden for synligt lys typisk er 500 nm er den mindst opnåelige d = 200 nm=0. 2 mikrometer. De 1. 51 er brydningsindeks for luften. Hvorfor er strukturer synlige i lysmikroskopi? Strukturer er synlige, da de absorberer forskellige dele af det hvide lys og derfor fremstår med forskelle i farve og intensitet (oftest skabt ved farvning af præparatet) Noget af lyset absorberes. Hvad sker der med det absorberede lys ? omdannes til varme i objektet og genudsendes som lys i andre bølgelængder. . . fluorescens! Hvornår opstår fluorescens? Fluorescens opstår, når et stof efter at have absorberet en foton, udsender en anden foton (større bølgelængde) Hvad skal man bruge for udelukkende at se fluorescensen? Ved brug af passende filtre, kan man nøjes med at se på det udsendte lys og på den måde udelukkende se fluorescensen Fluorescens mikroskopet Hvorledes anvendes flurescens ? Ved hjælp af f. eks. antistoffer kan fluorescerende stoffer bindes til bestemte dele (f. eks. et bestemt protein) af præparatet

Hvad er elektronmikroskopi baseret på? Hvad kan fasekontrastmikroskopet? Et fasekontrastmikroskop kan oversætte forskydning af fase til ændringer i amplitude, altså intensitetsforskelle. Elektronmikroskopi er baseret på elektronstråler Har elektronstråler kort eller lang bølgelængde? Elektronstråler har en meget kort bølgelængde (0, 005 nm, hvor lys typisk har 500 nm, altså 100000 x kortere bølgelængde) Hvad betyder elektronstrålen for opløsningsevnen ved elektronmikroskopi? Opløsningsevnen ved elektronmikroskopi er langt bedre en ved lysmikroskopi på grund af den langt mindre bølgelængde Hvad er opløsninsevnen for TEM? Hvad er der godt ved fasekontrastmikroskopet? Fasekontrast kræver ikke farvning og kan derfor bruges til levende celler Den er 0, 2 nm, men pga. støj fra præparatet er den typiske opløsningsevne 2 nm. Hvordan kan jeg bedst huske opløsningsevnen for de forskellige mikroskoper? Det blotte øje: 0, 2 millimeter Lysmikroskopi : 0, 2 mikrometer Elektronmikroskopi 0, 2 nanometer (2 nanometer i praksis)

Transmissions elektronmikroskopi (TEM) Katode Anode Kondensorlinse Hvad sker der mellem katoden og anoden? Elektroner frigives fra katoden og accelereres med 70 - 300 k. V mod anoden Hvad gør linserne? Elektromagnetiske linser (spoler) styrer strålen i en lufttom cylinder Objektivlinse Hvordan skal objektet være mht. tykkelsen? Objektet skal være meget tyndt (50 nm) for at elektronerne kan trænge igennem Hvordan vises billedet? Billedet vises på en fluorescerende skærm, optages på film eller med CCD-kamera. Projektorlinse Hvad viser billedet? Det viser objektets gennemtrængelighed for elektroner. Altså billedet er et fravær af elektroner. Hvad er nødvendigt for god kvalitet? Billede Tynde snit nødvendige, og farvning for at opnå god kontrast

Scanning elektronmikroskopi (SEM) Hvad sker der herinde? En system af elektromagnetiske linser får elektronstrålen til at scanne hen over objektet Elektronkilde Hvad gør detektoren? Opfanger elektroner, der reflekteres af overfladen. Linsesystem ”Scanner” Forklar det sidste der sker! Signalet fra detektoren forstærkes og vises på en skærm, der scanner i takt med elektronstrålen på objektet. Detektor Hvad resulterer det? Dette resulterer i et billede af objektets overflade TV-skærm Forstærker

Cytologisk teknik Hvad består væv af? Vand Proteiner Hvor findes de? i cytoplasma, i organeller og i membraner Lipider Hvad findes de som? Lipiddråber, membraner Kulhydrater Som fx? Nukleinsyrer Glykogengranula, glykosyleringer I form af? DNA, RNA Små opløste stoffer Som f. eks. Ioner, aminosyrer mm.

Vævspræparation bruges til? Hvilke fire punkter er der ved vævspræparation? Fiksering Indstøbning Snitning Farvning Fiksering Hvilke former for fiksering findes der? Hvad gør man ved fysisk fiksering? Fryser vævet Hvordan virker det? Virker ved at få vandet i vævet til at stivne Bliver stofferne fastholdt i vævet? De fleste stoffer fastholdes i vævet, men tabes let under videre bearbejdning Kemisk, fysisk Hvad er formålet med fiksering? Standse metabolske processer Bevare vævsstruktur Tilføre fysisk stabilitet Hvad bruger man til kemisk fiksering? Aldehyder Hvordan anvendes og virker de? Anvendes i opløst i vand. Virker ved at krydsbinde proteinerne i vævet Eksempler på aldyheder! Formaldyhed Glutaraldyhed osmium tetroxid Histologisk analyse Fikseringsprocedure Hvad gør man ved immersionsfiksering? Vævet skæres i små stykker Stykkerne placeres i fikseringsvæsken Hvad gør man ved perfusionsfiksering Fiksativ ledes ind i det levende væv via blodbanen Vævet skæres i stykker og placeres i fikseringsvæsken Indstøbning Hvilke former? Hvad fikserer det? Proteiner, lipider, kulhydrater og nukleinsyrer Hvordan virker det? Virker ved danne et netværk i vævet, hvor i vævets bestanddele holdes fast Paraffin, plast

Vævspræparation (fortsat) 3) Snitning Til hvilke mikroskoper? Lys- og elektronmikroskopi Hvad bruges der til snitning af væv til lysmikroskopi? Mikrotom Stålkniv Paraffinsnit (tykkelse 5 μm) Objektglas Hvad bruges der til snitning af væv til elektronmikroskopi? Ultra-mikrotom Glaskniv eller diamantkniv Plastsnit (tykkelse 50 nm) Grid (små metalnet) Mikrotom Kryo-ultramikrotom Hvad bruges der til snitning af væv ved frysesnit til lysmikroskopi? Kryostat Stålkniv Tykkelse af vævet: 10 μm Objektglas Hvad bruges der til snitning af væv ved frysesnit til elektronskopi? Ultracryomikrotom Glaskniv eller diamantkniv Tykkelse af vævet: 50 nm Grid (små metalnet) Ultramikrotom Kryostat

Vævspræparation (fortsat) 4) Farvning Hvilke 3 former? Uspecifik, selektiv, specifik Nævn de uspecifikke! hæmatoxylin, eosin, toluidinblå, sølv Nævn de selektive! Van Gieson (kollagen), Mallory-azan (bindevæv), PAS (kulhydrater), Orcein (elastin) etc. Nævn de uspecifikke! Feulgen (DNA), immunomærkning, enzymhistokemi (enzymfunktion), lectiner, in situ hybridisering (RNA), autoradiografi Levervæv Hvad er det for noget væv og hvad Hæmatoxylin og Eosin (HE) er det farvet med?

Hvide blodceller Basofil granulocyt Lymfocyt Eosinofil granulocyt Monocyt Neutrofil granulocyt Trombocytter

Række: Erythrocytrækken Hvide blodceller Række: Myolocytrækken Basofil erythroblast Myeloblast Promyelocyt Polykromatofil erythroblast Myelocyt Normoblast Metamyelocyt Stavkernet myelocyt