MIKROORGANIZMI VIRUSI BAKTERIJE ALGE GLJIVE LIAJEVI PROTOZOE Mikrobioloka

MIKROORGANIZMI VIRUSI BAKTERIJE ALGE GLJIVE LIŠAJEVI PROTOZOE

Mikrobiolo{ka laboratorija

Rad u mikrobiološkoj laboratoriji -laboratorije namenjene za rad sa različitim grupama mikroorganizama (virusi, bakterije, alge, gljive, lišajevi); -rad sa mikroorganizmima zahteva posebne mere opreznosti koje se sprovode u cilju zaštite i sprečavanja moguće infekcije i kontaminacije; -neophodna I obavezna pravila koja se moraju ispoštovati: 1. rad u sterilnim uslovima tj. delovima laboratorije ili u posebnim sterilnim prostorijama kao što su komore; 2. korišćenje isključivo sterilnog pribora i posuđa za rad; 3. u laboratoriji je obavezno nošenje belog mantila radi zaštite od kontaminacije; 4. obavezno pranje ruku pre a naročito posle rada; 5. zabranjeno je jesti, piti, pušiti u prostorijama namenjenim za rad sa mikroorganizmima;

6. ukoliko se kultura prospe nikako se ne sme kupiti rukama, preko nje prelije neko dezinfikujuće sredstvo I sačeka da deluje pa se onda adekvatnim priborom uklanja; 7. ukoliko na rukama postoje otvorene rane, ne sme se raditi sa kulturama mikroorganizama (u izuzetnim slučajevima dozvoljeno je ali uz upotrebu rukavica); 8. nakon završenog rada odbačene kulture se sterilišu, a posuđe adekvatno pere; -prvi I najvažniji uslov koji mora biti ispunjen u radu sa mikroorganizmima jeste STERILNOST -sterilni uslovi postižu se primenom postupka koji se zove STERILIZACIJA -sterilizacija je postupak uništavanja svih živih oblika organizama uključujućI I bakterijske endospore iz neke sredine pri čemu se postižu aseptični uslovi;

- dezinfekcija je postupak kojim se uništava određena nepoželjna grupa mikroorganizama tj. to je ciljana sterilizacija; (dezinficijensi I aseptici); -pasterizacija je postupak uništavanja vegetativnih oblika mikroorganizama povišenom temperaturom u cilju produžavanja roka trajanja namirnica (najčešće se vrši 20 minuta na 72 °C ili 5 minuta na 62 °C i naglim hlađenjem na 5 -10°C) - postoji veliki broj različitih načina sterilizacije pri čemu se svi oni mogu podeliti u 2 grupe : I FIZIČKE METODE sterilizacije II HEMIJSKE METODE sterilizacije I Fizičke metode: a) Toplotom b) Zračenjem c) Filtracijom d) Gasovima

Fizičke metode sterilizacije: a) Sterilizacija toplotom: -delovanje visokih temperatura izaziva privremene ili trajne promene kod mikroorganizama; -negativno dejstvo visokih temperatura ispoljava sa kroz denaturaciju a samim tim I inaktivaciju fiziološki važnih komponenata ćelije kao što su enzimi; -uginuće mikroorganizama je delom uslovljeno I toplotnom inaktivacijom RNK I oštećenjima citoplazmatske membrane; -vegetativne ćelije su naročito osetljive na delovanje visokih temeparatura za razliku od spora (konzervacioni oblici); -najveći broj vegetativnih oblika ugine nakon 10 -15 minuta na 60 -70 C, dok spore opstaju duže i na 100 C; -vrlo otporne spore vrste Clostridium botulinum ;

1. Suva toplota -plamen -topli vazduh 2. Vlažna toplota -kuvanje -vodena para: *strujeća vodena para *vodena para pod pritiskom *sterilizacija plamenom: -sterilizacija plamenom (flambiranje) primenjuje se za sav metalni pribor koji se koristi u radu sa mikroorganizmima (igle, eze, pincete, skalpeli. . ) a koji trpe visoke temperature (do usijanja) koje se razvijaju u plamenu(~500 C); *sterilizacija toplim vazduhom: -sterilizacija toplim vazduhom se primenjuje za stakleno posuđe (Petri ploče, epruvete, pipete, menzure…) I postupak se vršI u suvom sterilizatoru na temperaturi od 180 stepeni C I trajanju od 2 sata; (posuđe mora biti upakovano pre sterilizacije);

Suvi sterilizatori – sušnice

*sterilizacija kuvanjem: -sterilizacija vlažnom toplotom kuvanjem se primenjuje za različiti gumeni pribor (creva, čepovi…) kao I za neki metalni pribor; -ova sterilizacija podrazumeva kuvanje u vodi na 100 stepeni C pri čemu se u cilju povećanja efikasnosti I skraćenja vremena sterilizacije u vodu može dodati Na 2 CO 3; *sterilizacija strujećom vodemo parom: -sterilizacija strujećom vodenom parom zove se još I TINDALIZACIJA ili FRAKCIONA STERILIZACIJA; -ovaj vid sterilizacije se obavlja u Kohovom loncu (funkcioniše poput ekspres lonca) I sterilišu se sve hranljive podloge koje u sebi sadrže supstance koje ne trpe temperature veće od 100 C kao što su to šećeri; -sterilizacija se vršI u tri navrata na 100 C u trajanju od 20 minuta;

*sterilizacija vodenom parom pod pritiskom: -sterilizacija koja podrazumeva istovremeno delovanje visoke temeprature I pritiska na mikroorganizme u cilju njihovog uništavanja; -to je najčešćI vid sterilizacije koji se primenjuje u praksi I koristi se za sterilizaciju većine hranljivih podloga, odbačenih kultura… -ovaj vid sterilizacije se vršI u posebno dizajniranom uređaju koji se zove AUTOKLAV; -rad sa autoklavom zahteva posebnu opreznost radi zašite od povreda koje mogu nastati usled nestručnog rukovanja; -sterilizacija u autoklavu se vršI na temperaturi od 121 C pri čemu se na toj temperaturi razvija pritisak od 1 atmosfere, dok vreme trajanja sterilizacije zavisi od onog što se steriliše, Obično sterilizacija traje od 20 -30 minuta, retko 1 čas;

Autoklav

Glavni delovi autoklava

Princip sterilizacije u autoklavu

Primena u industriji

b) Sterilizacija zračenjem: 1. sterilizacija UV zracima - zraci kratkih talasnih dužina (do 380 nm) I energije koja izaziva ekscitaciju molekula koji ga apsorbuje; - dejstvo na mikroorganizme može biti mutageno I mikrobicidno, što zavisi od talasne dužine, intenziteta zračenja , od vrste mokroorganizma, od karakteristika sredine… - najvećI mikrobicidni efekat ima zračenje =265 nm što odgovara maksimalnoj apsorbciji DNK; - UV zračenje indukuje stvaranje fotoprodukata što dovodi do distorzije molekula DNK I inhibira replikaciju;

-za sterilizaciju radnih površina, mikrobioloških laboratorija, komora, operacionih sala koriste se ultravioletne lampe koje emituju zrake kraćih talasnih dužina od oko 250 nm (UV zraci) male prodorne moćI ; -UV zraci uništavaju mikroorganizme sa površine ka kojoj su usmerene, odnosno na koju direktno padaju-imaju izrazito površinsko dejstvo; -rad sa lampom zahteva opreznost s obzirom da UV zraci izazivaju I trajna oštećenja sluzokože (naročito očiju) I opekotina na koži; - UV lampa se uvek uključuje pre rada a obavezno mora biti isključena za vreme rada;

UV lampe

2. sterilizacija jonizujućim zracima -zračenje kratkih talasnih dužina (<10 nm) koja poseduju veliku energiju I prolaskom kroz materiju izazivaju promene u atomskoj strukturi – jonizaciju; - to su I X zraci; - niske doze ovog zračenja deluju mutageno a visoke mikrobicidno; - negativno dejstvo se zasniva na oštećenju molekula DNK koje nastaje direktnim cepanjem fosfodiestarskh veza I destrukcijom genetskog materijala ili dejstvo može biti indirektno, reakcijom sa slobodnim radikalima;

-jonizujuće zračenje – radijacija, za razliku od UV zraka, ima dubinsko mikrobicidno dejstvo, jer prodire u materiju izazivajućI jonizaciju I baš zbog toga nema široku primenu za sterilizaciju u mikrobiologiji; -najčešće korišćen emiter jonizujućih zraka jeste kobaltna bomba; --ovaj tip sterilizacije se koristi za sterilizaciju plastičnog posuđa I pribora za jednokratnu upotrebu (plastični špricevi, petri ploče, pipete …) pri njihovoj proizvodnji;

Kobaltna bomba

c) Sterilizacija filtracijom -sterilizacija filtracijom (mehanička sterilizacija) se koristi za sterilizaciju rastvora koji u sebi sadrže termolabilna jedinjenja koja se menjaju pod dejstvom toplote (zgrušavanje, razaranje enzima, vitamina, antibiotika, …); -sterilizacija se vršI pomoću vakum pumpe I specijalnih mikrobioloških filtera čije su pore sitnije od velićine mikroorganizama; -u ove svrhe se koriste različiti filtri kao što su: Filtri od azbesta (Sajc-ov) Filtri od negleđosanog porcelana (Čemberlen-ov) Filtri od dijatomejske zemlje (Berkfeld-ov) Membranski ultra filtri od nitroceluloze promera pora 0, 2 m -filtri su za jednokratnu upotrebu;

Aparat za filtriranje vakum pumpa

d) Sterilizacija gasom -ovaj vid sterilizacije se može svrstati I u hemijsku jer se koriste različite gasovite supstance u cilju uništavanja mikroorganizama; -najčešće se koriste : Gasovit formaldehid, Ozon (ozonizacija), Propilen-oksid, Etilen-oksid… -mogu se koristiti čisti gasovi ili u vidu smeše sa nekim inertnim gasom; -gasovi se koriste za sterilizaciju različitog pribora I sredina u mikrobiološkoj laboratoriji, međutim ovaj vid sterilizacije se koristi I u prehrambenoj industriji;

Ozonizator za bazene Gas-sterilizator

Tunel-sterilizacija

II Hemijske metode sterilizacije -podrazumeva upotrebu različitih hemijskih sredstava za uništavanje mikroorganizama; -u zavisnosi od načina delovanja na mikroorganizme sve hemikalije su podeljene u dve grupe: a) mikrobicidna jedinjenja (ubijaju MO) (viricidna, baktericidna, algicidna I fungicidna) b) mikrobistatička jedinjenja (usporavaju ili onesposobljavaju rast i razviće MO) -efekat delovanja hemijskih supstanci može biti rezultat: 1. Reakcije sa DNK 2. Interferencije sa molekulima proteina 3. Izmena u funkciji citoplazmatske membrane 4. Metabolički antagonizam (antimetabolizam)

-dejstvo zavisi od vrste hemikalije, od koncentracije, od vremena delovanja, od karakteristika vrste MO, od uslova sredine… -najčešćI dezificijensi pripadaju sledećim grupama jedinjenja: 1. kiseline (HCl, H 2 SO 4, HNO 3…) 2. baze (KOH, Na. OH…) 3. alkoholi (etilalkohol, lizol…) 4. halogeni elementi I njihova jedinjenja (Cl, Br, J…) 5. soli teških metala I teški metali (Hg, Cu, Ag, …) 6. sapuni I deterdženti -najčešće su u upotrebi za sterilizaciju u laboratorijama I bolnicama (za dezinfekciju radnih površina podova, zidova) sledeća sredstva: fenol, lizol, formalin I etil-alkohol;

Uređaji I pribor neophodan za rad sa mikroorganizmima 1. Metalni pribor (bakteriološke eze, igle, skalpeli, pincete…); 2. Stakleno posuđe (erlen-majer posude, petri ploče, pipete, čaše, menzure, epruvete, …); 3. Različiti aparati I uređaji (mikroskopi, laminari, termostati, frižideri, vodena kupatila, tresilice, mešalice, p. H-metri, centrifuge, analitičke vaga, spektrofotometar, fluorimetar, oksimetar…)

Stakleno posuđe

Analitičke vage

Centrifuge

Laminari

p. H-metar Vodeno kupatilo

Termostati

Tresilica (šejker) Spektrofotometar

Uslovi neophodni za gajenje I održavanje kultura različitih grupa mikroorganizama 1. Hranljiva podloga odgovarajućeg sastava za rast MO 2. Optimalna temperatura za rast 3. Odgovarajuća p. H vrednost podloge 4. Adekvatna atmosfera i osvetljenost 5. Odsustvo konkurentskih organizama

Mikrobiološke podloge -hranljive podloge specifičnog sastava za kultivaciju određenih grupa mikroorganizama; -hranljiva podloga mora da sadrži: vodu, makroelemente (C, N, H, O, P, S) mikroelemente, a ponekad i vitamine; -po poreklu podloge se dele na: PRIRODNE 1. biljnog porekla 2. životinjskog porekla -po konzinstenciji podloge se dele na : • tečne i • čvrste (agarizovane) VEŠTAČKE 1. nesintetičke 2. sintetičke

-prema nameni podloge se dele ne: 1. Neselektivne podloge - predstavljaju podloge u kojima se nalaze takve supstance koje omogućavaju rast većine mikroorganizama (primer su podloge mesopeptonski agar i mesopeptonski bujon); 2. Selektivne podloge – predstavljaju čvrste hranljive podloge u čiji sastav ulaze takve supstance koje stimulišu rast jedne a inhibišu rast druge gupe mikroorganizama, odnosno omogućavaju selekciju pojedinih kolonija i dobijanje čistih kultura (primeri su podloge sa antibioticima, Simons-citratni agar. . . ) 3. Diferencijalne podloge – su čvrste podloge koje sadrže indikator pomoću koga se kolonije jednog tipa mikroorganizama razlikuju od drugog (primeri su MOF podloga, ENDO agar. . . )

Kultivacija mikroorganizama