Mikrobni rast U bakteriologiji rast poveanje broja elija
Mikrobni rast
U bakteriologiji rast - povećanje broja ćelija (binarna dioba) Svaka ćerka ćelija dobija - kompletan hromozom, ribozome - dovoljan broj kopija svih makromolekula - monomera, - neorganskih jona - flagele, inkluziona tijela, itd.
Pupljenje se javlja kao izdanak na površini ćelije. Taj pupoljak kada dostigne odgovarajuću veličinu sam otpadne i tako nastaje nova ćelija Grananje je prisutno kod nekih bakterija naročito bacila iz roda Coribacterijum. Može doći do račvanja jednog kraja bacila na dvije grane, i jedna od od tih grana može da poraste i da se odvoji kao samostalna jedinka Stvaranje L- oblika: neke bakterije se prirodno lako razmnožavaju a neke samo u nepovoljnim uslovima npr. samo u prisustvu subletanih doza antibiotika. Razmnožavanje se odvija tako što se stvara veliko tijelo –forma u kojoj dolazi do dijeljenja jedarnog materijala, njegove replikacije i formiranja velikog broja mladih jedinki, prečnika oko 200 nm.
Seksualno razmnožavanje preko seksualnih fimbrija dolazi do konjugacije izmedju muških E i ženskih F ćelija (tako se odvija miješanje jedarnog materijala) -nakon miješanja jedarnog materijala, ove ćelije se dijele binarnom deobom na po dvije ćerke ćelije. Dobijene ćerke ćelije sadrže nukleinski materijal oba roditelja i po osobinama liče na oba konjugata
Sinteza ćelijskog zida i dioba ćelija • Autolizini formiraju otvore u zidu. • Baktoprenol hidrofobni nosač dodaje disaharid pentapeptid kroz membranu.
Rast populacije • Rast - povećanje broja ćelija mikroorganizama u populaciji • Može se mjeriti i kao povećanje mase mikroorganizama • Brzina rasta - promjena u broju ili masi ćelija u jedinici vremena • Generacija - interval za koji se formiraju dvije ćelije od jedne • Vrijeme generacije – vremeski period za koji se duplira ćelijska populacija (1 -3 h)
Rast bakterija • Populacije mikroorganizama pokazuju karakterističan rast - eksponencijalni rast. • Povećanje broja ćelija u funkciji vremena. • Vrijeme neophodno za kompletan životni ciklus bakterija je veoma varijabilno i zavisi od uslova spoljašnje sredine i genotipa. • U optimalnim uslovima E. coli životni ciklus se odvija za 20 minuta.
RAST
• Ukoliko se broj ćelija unese na logaritamsku skalu a vremenski intervali u aritmetičkoj (semilogaritamski grafikona) dobija se kriva rasta
• Tipična kriva rasta bakterija može se podijeliti na nekoliko različitih faza: - lag, - eksponencijalna (log), - stacionarna i - faza smrti.
• Mjerenje rasta populacije: - praćenje broja ćelija - praćenje mase ćelija
Direktno brojanje pod mikroskopom • Suv ili vlažni preparat. • Komora za brojanje - stakleni nabori na koji okružuju kvadrate poznatih dimenzija i volumena. • Broj ćelija po jedinici površine određen pod mikroskopom i množenje faktora konverzije koji zavisi od volumena komorice.
Određivanje broja vijabilnih bakterija - ćelije sposobne da se dijele (vijabilne) formiraju kolonije na čvrstoj hranljivoj podlozi 1. Metoda utrljavanja - 0. 1 ml odgovarajućeg razblaženja bakterij utrlja se na površinu čvrste hranljive podloge sterilnim štapićem, - nakon inkubacije broje se kolonije i određuje broj vijabilnih ćelija
2. Metoda iscrpljivanja - 0. 1 -1 ml kulture se pipetom unese u sterilnu petri šolju, doda se rastopljeni hranljivi agar (45 C), dobro izmješa i inkubira
Razređenja Optimalan broj kolonija po petri šolji 30 -300.
• Da bi se dobio odgovarajući broj kolonija uzorak skoro uvijek mora biti razređen (napravljena dilucija) • Rijetko se zna približan broj vijabilnih ćelija u uzorku pa je neophodno napraviti veći broj različitih razređenja • Koriste se decimalna razređenja: 10 x razblaženje 10 -1 0. 5 uzorka i 4. 5 ml fiziološkog rastvora ili 1 ml uzorka i 9 ml fiziološkog rastvora. 100 x razređenje 10 -2 0. 05 ml uzorka i 4. 95 fiziološkog ili 0. 1 ml i 9. 9 ml fiziološkog rastvora. Najčešće je neophodan serija decimalnih razređenja
• Bez obzira na sve teškoće pri određivanju broja vijabilnih ćelija ova procedura daje najbolju informaciju i široko se koristi. • Metod je veoma senzitivan pa se u uzorcima sa nekoliko ćelija može odrediti broj (detekcija mikroorganizama koji kontaminiraju različite produkte). • Na visoko selektivnim medijumima i specifičnim uslovima rasta mogu se iz mješovite kulture izolovati određene vrste.
Mjerenje ćelijske mase • Masa ćelija proporcionalna broju, određivanje jednog parametra koristi se za procjenu drugog. • Masa ćelija može biti određena koncentracijom (npr. centrifugiranjem) poznatog volumena i mjerenjem dobijenog taloga. • Uobičajeno se određuje suva težina nakon sušenja taloga na 90 -110 C preko noći (10 -20% od vlažne mase).
Indirektna metoda –Mjerenje zamućenja (turbidity) • Metod za dobijanje podataka o broju i masi ćelija je određivanje turbiditeta. • Ćelije rasipaju svjetlo koje prolazi kroz suspenziju, više ćelija više svjetlosti se odbije, veći je turbiditet suspenzije. • Fotometar ili spektrfotometar - aparati određuju koja količina emitovane svjetlosti je propuštena kroz suspenziju.
• Fotometar - jednostavni filteri (crvene, zelene i plave) za svjetlost širokog spektra (jedinice “Klett” po Klett Summerson fotometru). • Spektrofotometar- prizma ili difrakcioni distributer za generisanje svjetla određenih talasnih dužina (jedinice optičke gustine. OD, optical density units).
Kontinualna kultura - Hemostat • Održavanje ćelija u eksponencijalnoj fazi rasta u dužem vremenskom periodu. • Hemostat - najedostavniji aparat za dobijanje kontinualne kulture je sa kontrolom gustine populacije i faze rasta kulture. • Protočni sistem konstantnog volumena, medijum se dodaje kontinualno a odvodi medijum sa mikroorganzmima.
Fermentori
Sinhroni rast • Dobijanje kulture u kojoj se sve ćelije nalaze u istoj fazi rasta. • Sinhronizacija - separacijom malih ćelija odmah nakon diobe: • Filtriranje, ćelije se “zalijepe” za filter papir pa spiranjem okrenutog filtera hranljivim medijumom odvajaju samo novopodjeljene ćelije (ista faza).
• Diobe će biti sinhronizovane samo nekoliko generacija, zatim se gubiti sinhroni rast.
Efekat temperature na rast • Jedan od najvažnijih faktora, veliki uticaj na rast i preživljavanje. • Za svaki organizam postoji: - temperaturni minimum (ispod koga nema rasta), - temperaturni optimum (rast najbrži, uvek bliži maksimumu) - temperturni maksimum (iznad koga rast nije moguć, posledica inaktivacije proteina, nukleinskih kiseline i drugih komponenti koje mogu biti ireverzibilno oštećene).
Efekat temperature na rast
Psihrofili, ispod 0 - 20 C; optimum 13 C; Mezofili, 10 -50 C, optimum 39 C; Termofili, 40 -70 C, optimum 60 C; Hipertermofili, 70 -100 C (80 -110 C), optimumi 88 C (105 C).
Hipertermofili, (Yellowstone 97 -99 C. ) Rast termofilnih cijanobakterija (Yellowstone 70 -74 C. )
Značaj termofila i hipertermofila • Enzimi termofila i hipertermofila katalizuju reakcije na visokim temperaturama. • DNK polimeraza Thermus aquaticus (Taq) koristi se za PCR, amplifikaciju sekvenca DNK.
p. H • Neutrofili - optimalni p. H 6 -8, (najčešća staništa u prirodi p. H 5 -9) • Acidofili – niže od p. H 5 (gljive i obligatni acidofili) (Thiobacillus ferroxidans i Sulfolous oksiduju minerale sulfida i produkuju H 2 SO 4) • Alkalifili - optimalni rast p. H 10 -11 (visokobazne sredine, slana jezera i zemljišta bogata karbonatima (aerobne bakterije slatkih voda, Bacillus a neki ekstremni alkalifili su i halofili, Archaea) • Intracelularni p. H može varirati samo za 1 - 1. 5 p. H jedinica od neutralne.
Puferi • U toku rasta mikroorganizama u medijumu dolazi do promjene vrijednosti p. H usljed metaboličkih reakcija. • Puferi se dodaju radi održanja konstantne p. H. • p. H 6 -7, 5 koriste fosfati, KH 2 PO 4
Osmotski pritisak • Većina mikroorganizama ne može da preživi uslove sa niskom vodenom aktivnošću, dehidriraju, prelaze u dormantno stanje ili umiru (plazmoliza), sredina analogu suvom staništu. • HALOFILI – 1 -6% ili 6 -15% Na. Cl. • EKSTREMNI HALOFILI, 15 -30% Na. Cl za optimalni rast. • HALOTOLERANTNI tolerišu donekle redukciju dostupnosti vode. • OSMOFILI - sa visokom koncentracijom šećera.
O 2 AEROBI - 21% O 2, mogu tolerisati i povećanu koncentraciju (hiperbarični kiseonik). FAKULTATIVNI AEROBI - u aerobnim i anaerobnim uslovima. MIKROAEROFILI - O 2 u koncentraciji manjoj od 21%, (limitirani kapacitet za respiraciju ili enzimi osetljivi na O 2). ANAEROBI - ne kosriste O 2 kao terminalni akceptor elektrona. - AEROTOLERANTNI ANAEROBI - rastu u prisustvu O 2. - OBILGATNI (ili STRIKTNI) ANAEROBI - O 2 je toksičan, nemaju enzime za uklanjanje toksičnih produkata kiseonika.
Anaerobni mikroorganizmi • Obligatni – striktni anaerobni: prokarioti, neke gljive i protozoe. • Anaerobne bakterije Clostridium, grupa gram + štapićastih bakterija koje formiraju endospore. • Nalaze se u zemljištu, sedimentima jezera, interstinalnom traktu, odgovorne za kvarenje konzervirane hrane. • Metanogeni (Archaea), sulfat-redukujuće i homoacetogene bakterije, bakterije rumena, crijeva.
• Za identifikovanje bakterija uglavnom se koriste čvrste podloge na kojima se mogu razlikovati kolonije različitih vrsta • Kolonija predstavlja skup bakterija koje se nastale od jedne bakterijske ćelije • Izgled kolonija zavisi od genetskih osobina bakterije (produkcija kapsule, sinteza endopigmenta, pokretljivost) i uticaja spoljašnjih faktora
Kolonije različitih vrsta bakterija se razlikuju na osnovu : -veličine (neke su veoma sitne i vidljive samo pod lupom); -oblika (okrugao, filamentozan, nepravilan itd. ) i uzdignutosti (ispupčene, pljosnate, sa centralnim ulegnućem itd. ); -ivica (ravne, talasaste, nazupčene itd. ); -površine (glatka, hrapava, zrnasta itd. ); -prozračnosti na providnim podlogama (prozračne i neprozračne); - konzistencije koja se procenjuje kada dodirnemo koloniju bakteriološkom ezom (suve, vlažne, sluzave itd. ); - boje koja može poticati od endopigmenta koji boji samo koloniju (karakteristično za Staphylococcus aureus) ili egzopigmenta koji difunduje i boji celu podlogu (Pseudomonas aeruginosa).
MIJEŠANA KULTURA
Kontrola mikroorganizama Termini: Mikrobiološke rezistencije Sterilizacija: fizička i hemijska Dezinfekcija: niži nivo, srednji nivo i visok nivo Antiseptik Germicid
Faktori antimikrobne aktivnosti • • • Mikrobna osjetljivost Broj mikroba Koncentracija ili doza agensa Dužina izloženosti Uslovi sredine
Mikrobiološke rezistencije • • Endospore Clostridium tetani Mycobacterium tuberculosis Coxsackie virus Spore gljiva Ciste parazita Hepatitis B Vegetativne bakterije Herpes simplex virus
Sterilizacija • Potpuno ubijanje svih mikroorganizama, uključujući vegetativne ćelije, spore i viruse Tipovi sterilizacije • • • Vlažna Pasterizacija Suva Radijacija Filtracija
Vlažna sterilizacija u autoklavu 121 stepen C, 101. 3 k. Pa, 30 minuta
Priprema sterilizacije • • Deterdženti Hrom sumporna kiselina Kalijum di hromat Destilovana voda
Pakovanje čistog materijala
Pasterizacija • Niska pasterizacija: 30 minuta na 62. 8 stepeni • Visoka pasterizacija: 15 sekundi na 71. 6 stepeni • Ultra visoka pasterizacija: 3 sekunde na 141 stepeni
Suva sterilizacija 1 -2 h na 170 -180 stepeni
• • • Filtracija Vaši: 1 mm Paraziti: 5 -100 m Kvasci: 1 mm Bakterije: 2 m Mikoplazme: 0. 5 m Mali virusi: 0. 2 m
- Slides: 57