MIKROBIOLOKO ISPITIVANJE MLEKA I PROIZVODA OD MLEKA dr
MIKROBIOLOŠKO ISPITIVANJE MLEKA I PROIZVODA OD MLEKA dr Vera Katić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine
Kriterijumi bezbednosti hrane Kategorija hrane Mikroorganizmi/ njihovi toksini, metaboliti Plan uzorkovanja n c Granične vrednosti m М Referentna metoda ispitivanja EN ISO 11290 -2 Proizvod u prometu tokom njegovog roka upotrebe. EN ISO 11290 -1 Pre nego što hrana prestane da bude pod neposrednom kontrolom subjekta koji je proizveo 1. 1 5 Hrana spremna za konzumiranje koja podržava rast L. monocytogenes 1. 2 Hrana spremna za konzumiranje koja ne podržava rast L. monocytogenes (4) (8) 0 100 cfu/g Listeria monocytogenes 5 0 0 Ne sme biti u 25 g 100 cfu/ g Faza u kojoj se kriterijum primenjuje EN ISO 11290 -2 Proizvod u prometu tokom njegovog roka upotrebe.
Hrana spremna za konzumiranje (proizvodi od mleka) Kriterijum broj Mikroorganizam i kategorija hrane Primeri (lista nije zatvorena) 1. 1 L. monocytogenes u hrani spremnoj za konzumiranje koja podržava njen rast Meki sir (sirevi sa sekundarnim zrenjem: bri, gorgonzola, kamambert idr). 1. 2 L. monocytogenes u hrani spremnoj za konzumiranje koja ne podržava njen rast Sladoled; Fermentisani proizvodi od mleka; Tvrdi sir; Proizvodi sa rokom upotrebe kraćim od 5 dana: npr. Pasterizovano mleko.
Kriterijumi bezbednosti hrane Poglavlje 1 tačka 1. 10; 1. 11; 1. 12 Kategorija hrane Mikroorganizmi/ Plan Granične njihovi toksini, uzorkovanja vrednosti metaboliti n c m M Referentna Faza u kojoj metoda se kriterijum ispitivanja primenjuje Sirevi, maslac I pavlaka proizvedeni od sirovog mleka ili mleka obrađenog tem. nižom od past. Salmonella 5 0 Ne sme biti u 25 g EN/ISO 6579 Proizvod u prometu tokom roka potrebe Mleko u prahu i surutka u prahu Salmonella 5 0 Ne sme biti u 25 g EN/ISO 6579 Proizvod u prometu tokom roka upotrebe Sladoled izuzimajući Salmonella proizvode kod kojih proces proizvodnje ili sastav eliminišu rizik od salmonela 5 0 Ne sme biti u 25 g EN/ISO 6579 Proizvod u prometu tokom roka upotrebe
Kriterijumi bezbednosti hrane Poglavlje 1 tačka 1. 20 Kategorija hrane Mikroorganizmi/ Plan njihovi toksini, uzorkovanja metaboliti n c Sirevi, mleko u prahu Stafilokokni i surutka u prahu enterotoksini kako je navedeno u kriterijumu za koagulaza pozitivne stafilokoke u poglavlju 2. 2. ovog priloga 5 0 Granične Referentna Faza u kojoj vrednosti metoda se kriterijum ispitivanja primenjuje m M Ne sme biti u 25 g Evropska skrining metoda, CRL za mleko Proizvod u prometu tokom roka potrebe
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 1) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Pasterizovano mleko Enterobateriaceae i drugi pasterizovani tečni proizvodi od mleka Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 0 Referent. metoda isitivanja M 10 cfu/g ISO 21528 -2 Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Kraj proizvodno g rocesa Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata Provera efikasnosti toplotne obrade i sprečavanje ponovne kontaminacije
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 2) Kategorija hrane Mikroorganizmi mjihovi toksini, metaboliti Sirevi proizvedeni E. coli od mleka ili surutke koji su obrađeni toplotom Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 2 100 cfu/g Referent. metoda isitivanja M 1000 cfu/g ISO 16649 -1 ili ISO 16649 -2 Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Za vreme proizvodnog procesa, u vreme kada se očekuje da će broj kolonija E. coli biti najveći Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina.
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 3) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Koagulaza Sirevi proizvedeni pozitivne od sirovog stafilokoke mleka Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 2 104 cfu/g Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata ISO 6888 -1 ili ISO 6888 -2 Za vreme proizvodnog procesa, u vreme kada se očekuje da će broj stafilokoka biti najveći Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina M 105 cfu/g
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 4) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Sirevi proizvedeni od mleka koje je obrađeno toplotom Koagulaza na temperaturi pozitivne nižoj od stafilokoke temperature pasterizacije, sirevi sa zrenjem proizvedeni od pasterizovanog mleka ili surutke, ili od mleka ili surutke obrađenih jačim režimom toplotne obrade Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 2 100 cfu/g Referent metoda isitivanja M 1000 cfu/g ISO 6882 -1 ili ISO 6882 -2 Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata Za vreme proizvodnog procesa, u vreme kada se očekuje da će broj stafilokoka biti najveći Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina
Primer: Kriterijum za hranu u kojoj se određuje broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (tačka 2. 2. 5. ) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Meki sirevi bez Koagulaza pozitivne zrenja (sveži stafilokoke sirevi) proizvedeni od mleka ili surutke koji su pasterizovani ili obrađeni jačim režimom toplote Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 2 10 cfu/g Referent. metoda isitivanja M 100 cfu/g ISO 6888 -1 ili ISO 6888 -2 Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Kraj proizvodnog procesa Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata Poboljšanje higijene proizvodnje. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 6) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Maslac i pavlaka E. coli proizvedeni od sirovog mleka ili mleka koje je obrađeno toplotom na temperaturi nižoj od temperature pasterizacije Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 2 10 cfu/g Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje ISO 16649 -1 ili ISO 16649 -2 Kraj Poboljšanje higijene proizvodnog proizvodnje i izbora procesa sirovina. M 100 cfu/g Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 7) Kategorija hrane Mleko u prahu i surutka u prahu Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Enterobateriaceae Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 5 Koagulazap ozitivne stafilokoke c Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata ISO 21528 -1 Kraj proizvodnog rocesa Provera efikasnosti toplotne obrade i sprečavanje ponovne kontaminacije 100 EN ISO cfu/g 6888 -1 Ili ISO 6888 -2 Kraj proizvodnog rocesa Poboljšanje higijene proizvodnje. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina M 0 10 cfu/g 2 10 cfu/g
Tumačenje rezultata primera Kriterijum 2. 2. 7. iz Priloga 1. , Poglavlja 2. q Zadovoljavajući: Ako su sve dobijene vrednosti za Enterobateriaceae u svih pet jedinica uzorka manje od 10 cfu/g (<m) i, ako je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u svih pet ispitivanih jedinica uzorka manji od 10 cfu/g. q Prihvatljiv: Ako su maksimalno 2 (c) od 5 (n) dobijenih vrednosti za koagulaza pozitivne stafilokoke između 10 i 100 cfu/g (između m i M), a ostale dobijene vrednosti manje ili jednake 10 cfu/g (≤m). q Nezadovoljavajuć: Ako je jedna ili više dobijenih vrednosti za koagulaza pozitivne stafilokoke veća od 100 cfu/g ili (>M), ili ako je u više od 2 (c) od ispitivanih 5 (n) jedinica vrednost između 10 i 100 cfu/g (između m i M).
Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2. 2. 8) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Sladoled i Enterobacteriaceae smrznuti mlečni dezerti Plan uzorkovanja Granične vrednosti n m 5 c 2 Referent. metoda isitivanja M 10 cfu/g ISO 21528 -2 Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata Kraj Poboljšanje proizvodnog higijene rocesa proizvodnje
Metode ispitivanja q Za ispitivanje se moraju koristiti referentne metode propisane u okviru mikrobioloških kriterijuma. q Prihvatljiva je primena alternativnih metoda ispitivanja: q q ukoliko se validacija datog metoda vrši u odnosu na referenti metod naveden u Pravilniku (Sl. glasnik RS broj 72/10) ili ukoliko subjekt u poslovanju hranom primenjuje metod koji je sertifikovan od treće strane u skladu sa protokolom utvrđenim EN/ISO standardom 16140 ili nekim drugim međunarodno priznatim protokolom, a njihovo korišćenje odobreno od strane Ministarstva nadležnog za poslove poljoprivrede.
Izolovanje i identifikacija Listeria monocytogenes iz hrane i hrane za životinje ISO – 11290 -1 -2004 Omčicom po Površini ALOA 24 -28 h na 37 C 25 g/ml uzorka za ispitivanje u 225 ml ½ Frejzer bujona 24 h na 30 C 0, 1 ml u 10 ml Frejzer bujona 48 h na 37 C Pet tipičnih kolonija (zeleno-plave kolonije) presejava se na triptone soya yeast extract agar (TSYEA) -Inkubacija 18 -24 h na 37 C. Identifikacija: Gram (+), katalaza (+), pokretljivost (+), CAMP (+), β-hemoliza (+), glukoza (+), ramnoza (+), ksiloza (-)
Listeria monocytogenes EN ISO 11290 - 2: 2000 Izolacija Revitalizacija 1 čas i Razređenje 1: 10 0, 1 m. L Puferisana Peptonska voda Ili osnovna podloga za ½ bujon po Frejzeru ALOA 48 h- 37°C TSYEA Karakterističan Rast na ALOA 18 -24 h na 37°C podlozi
Rast L. monocytogenes na ALOA podlozi (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)
Listeria monocytogenes n Potvrda na osnovu biohemijskih osobina q Bojenje po Gramu q Pokretljivost Metod 1 Inokulisati TSYEB 24 2 h pri 30°C Mikroskopiranje Sitni štapići, slabo pokretni Metod 2 Inokulisati agar za pokretljivost 48 4 h pri 30°C Ispitati rast u podlozi rast u vidu kišobrana
Test pokretljivosti
Listeria monocytogenes n Potvrda na osnovu biohemijskih osobina test -hemolize na krvnom agaru (ovčija krv) Sposobnost da lizira eritrocite Metod 1 • Zasejati krvni agar • 24 2 h pri 37°C • Uska jasna zona Metod 2 Zasejati BHI bujon 24 2 h – 48 pri 37°C Mikrotitarske ploče: 6 x 100 l eritrocita ovna+2 x 100 l bakterijske kulture+2 x pozitivna kontrola +2 x negativna kontrola 30 -45 min pri 37°C i 2 h pri 5 °C Pozitivna reakcija: homogeno crveno
Listeria monocytogenes – CAMP test
Izolacija i identifikacija L. monocytogenes q različite vrste unutar roda Listeria se razlikuju određivanjem biohemijskih osobina q brzi test-API Listeria - uključuje određivanje 10 najvažnijih biohemijskih osobina
Detekcija Salmonella - ISO Standard 6579 25 g/ml ispitivanog uzorka u 225 ml/g PPV 16 -20 h pri 35 -37 C 1. dan 2. dan 0, 1 ml iz PPV u 10 ml RVS bujona 24 h/ 41, 5 C 3. dan XLD agar Bilo koji drugi 24 h/35 -37 C agar za Salmonella 1 ploča 14 cm 2 ploče 9 cm 4. dan 1 ml iz PPV u 10 ml MKTTn bujona 24 h pri 37 C XLD agar 24 h/35 -37 C 1 ploča 14 cm 2 ploče 9 cm Bilo koji drugi agar za Salmonella 1 ploča 14 cm 2 ploče 9 cm Očitavanje rezultata-rast na hranljivim podlogama Rappaport-Vassiliadis podloga sa sojom (RVS bujon); Muller-Kauffmann tetrationat/ novobiocin bujon (MKTTn bujon); ksiloza lizin deoksiholat agar (XLD agar).
Izgled kolonija Salmonella spp. na XLD agaru
Salmonella spp. EN-ISO 6579 : 2003 Pet tipičnih kolonija na hranljivi agar/ inkubacija 24 3 na 37 C Potvrda Biohemijska + TSI agar Urea agar + Dekarboksilacija lizina Serološka potvrda Beta dekaboksilaza + Voges Proskauer Indol
Metode za odredjivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u hrani n Mikrobiologija hrane i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste) — Deo 1: Tehnika agara po Berd-Parkeru (Baird-Parker) (EN ISO 6888 -1: 1999 + A 1: 2003, IDT; ISO 68881: 1999 + Amd 1: 2003). n Mikrobiologija hrane i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste) — Deo 2: Tehnika agara sa plazmom kunića i fibrinogenom (EN ISO 6888 -2: 1999 + A 1: 2003, IDT; ISO 68882: 1999 + Amd 1: 2003). n Mikrobiologija hrane i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste) — Deo 3: Otkrivanje i MPN tehnika za male brojeve (ISO 6888 -3: 2003).
Izolovanje Staphylococcus aureus EN ISO 6888 -1: 2000 0, 1 m. L Koagulaza 37 1 o. C Do 24 0, 1 m. L BHI o 37 1 C – 24 2 h S. aureus Druge stafilokoke Baird Parker agar 37 1°C – 24 -48 h
Izgled kolonija koagulaza pozitivnih stafilokoka na Baird Parker podlozi
Izolovanje Sraphylococcus aureus EN ISO 6888 -2: 2000 + 1 m. L L 1 m S. aureus Rabbit Plasma Fibrinogen Agar 35 -37 1°C – 18 - 24 h -
Izgled kolonija koagulaza pozitivnih stafilokoka na Rabbit Plasma Fibrinogen Agar podlozi
Identifikacija izolovata Staph. aureus n Koagulaza test q Preneti 5 sumnjivu koloniju u BHI- bujon q 24 (± 2)h/ 37˚C q 0, 1 ml bujonske kulture +0, 3 ml plazme u sterilne epruvete q Inkubacija pri 37˚C q Rezultati se očitavaju posle 4 -6 h, 18 i 24 časa. q q q Zasejava se pozitivna kontrola sa referentnim sojem sigurno koagulaza pozitivnim. Negativna kontrola je nezasejana plazma. Pozitivna reakcija u epruveti zasejanoj pozitivnim sojem i ispitivanim izolatom, a negativna reakcija (izostanak koagulacije plazme) očitava se kao koagulaza pozitivan soj.
Izolovanje Staph. aureus iz hrane na RPF (rabbit plasma in place of pig plazma) podlozi n 1 ml iz decimalnog razblaženja se prelije sa 10 ml RPF podloge. q q q Karakteristike RPF podloge n Ne sadrži žumance jajeta. n Ista osnova podloge kao i za BP sa kalijum teluritom. n Bovini fibrinogen precipitacija n Plazma n Inhibitor tripsina: prevenira razlaganje precipitata dejstvom tripsina (stvara ga S. aureus) stimuliše precipitaciju Inkubacija 48(± 4)h/ 37˚C; kolonije se broje posle 24 i 48 h Pozitivna reakcija: sjajne, sive, crne kolonije okružene precipitatom.
Izračunavanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka gde su: Ac Anc bc bnc cc cnc broj tipičnih kolonija koje se podvrgavaju koagulaza ispitivanju; broj atipičnih kolonija koje se podvrgavaju koagulaza ispitivanju; broj tipičnih kolonija za koje je pokazano da su koagulaza pozitivne; broj atipičnih kolonija za koje je pokazano da su koagulaza pozitivne; ukupan broj tipičnih kolonija viđenih na ploči; ukupan broj atipičnih kolonija viđenih na ploči.
Izračunavanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka a zbir kolonija koagulaza pozitivnih stafilokoknih identifikovanih na svim odabranim pločama; V zapremina inokuluma na svakoj ploči, u mililitrima; n 1 broj ploča odabranih pri prvom razblaženju; n 2 broj ploča odabranih pri drugom razblaženju; d stepen razblaženja koji odgovara prvom odabranom razblaženju (početna suspenzija je razblaženje).
Horizontalna metoda za otkrivanje i određivanje broja Enterobacteriaceae – Metoda brojanja kolonija SRPS ISO 21528 -2 Potvrdni testovi Izolacija Uzorak 1 ml m 5 1 l Oksidaza 20 g/ml l 180 ml 1 m FR Enterobacteriaceae VRBG 24 2 h 37 C Hranljivi Agar 24 2 h-37 C Fermentacija Glukoze 24 2 h-37 C
Horizontalna metoda za otkrivanje i određivanje broja Enterobacteriaceae Otkrivanje i odredjivanje broja MPN tehnikom SRPS ISO 21528 -1 Doda se 1 ml dela uzorka za Ispitivanje u 9 ml PPV Doda se x g dela uzorka za Ispitivanje u 9 xml i PPV homogenizuje Uzorak 10 -1 3 x 10 ml E. 1 E. 2 Bez dodataka E. 3 10 -1 3 x 1 ml E. 1 E. 2 10 -2 3 x 1 ml E. 3 E. 1 E. 2 E. 3 Doda se 9 ml PPV i promeša Inkubira se svih 9 inokulisanih epruveta na 37°C tokom 18 2 h Preseje se 1 ml kulture u 10 ml bujona za obogaćenje i inkubira 24 2 h na 37°C
Horizontalna metoda za otkrivanje i određivanje broja Enterobacteriaceae Otkrivanje i odredjivanje broja MPN tehnikom SRPS ISO 21528 -2 Nastavak predhodnog slajda Zaseje se ezom na površinu VRBG agara i inkubira 24 2 h na 37°C Izabere se pet karakterističnih kolonija i svaka zaseje na hranljivi agar (24 2 h pri 37 °C) Karakteristične kolonije su ružičaste do crvene ili purpurne sa zonom precipitirane žuči ili ne. Prisustvo Enterobacteriaceae se potvrđuje na osnovu: -Oksidaza testa (-) -Fermentacije glukoze (+) Za određivanje MPN koristi se tabela data u tačci 9. 4 standarda ISO 7218.
Određivanje broja Escherichia coli q Mikrobiologija prehrambenih proizvoda i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja β-glukuronidaza pozitivne Escherichia coli — Deo 1: Tehnika brojanja kolonija na 44 C pomoću membrana i 5 bromo-4 -hloro-3 -indolil-β-d-glukuronida (SRPS ISO 16649 -1 ) q Mikrobiologija prehrambenih proizvoda i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja β-glukuronidaza pozitivne Escherichia coli — Deo 2: Tehnika brojanja kolonija na 44 C pomoću 5 -bromo-4 -hloro 3 -indolil-β-d-glukuronida (SRPS- ISO 16649 -2 )
Escherichia coli EN – ISO 16649 - 2: 2001 Za određivanje -glukuronidaza- pozitivnih E. coli pri 44 °C koristi se: 5 -bromo-4 - hloro-3 - indolil – - D-glukuronid Plave: E. coli 1 m. L 1 m L 15 m. L TBX Tryptone Bile X-glucuronide AGAR (TBX) 18 24 h - 44 °C Druge bakterije TBX
Izgled kolonija Escherichia coli na TBX agaru
- Slides: 42