Mikobakteri enfeksiyonlarnda yeni tan yntemleri Dr Cengiz avuolu

Mikobakteri enfeksiyonlarında yeni tanı yöntemleri Dr. Cengiz Çavuşoğlu Tıbbi Mikrobiyoloji AD

2050 TB Eliminasyon Hedefi (WHO; Global Tuberculosis Report 2012) ║ • İlaca duyarlı ve ilaca dirençli TB tanısında ilerleme (FIND) + • BCG’den daha etkili bir aşı ile kitle aşılaması (Aeras; TBVI) + • Tüm TB formları için daha etkili ve kısa süreli tedavi rejimleri (TB Alliance) + • Latent TB enfeksiyonu olan kişilerin geniş ölçekli tedavisi 2/25

Mikrobiyolojik tanı • Konvansiyonel yöntemler • Mikroskobik inceleme • Kültür (tanımlama-duyarlılık testleri) • İmmünolojik yöntemler • Tüberkülin deri testi (TDT) • İnterferon-γ salınım testleri (İGST) • Moleküler yöntemler • Biyobelirteçler ? 3/25

Biyobelirteç Normal biyolojik süreçlerin, patolojik süreçlerin veya terapötik bir işleme karşı farmakolojik yanıtın bir göstergesi olarak objektif olarak ölçülüp değerlendirilebilen özelliklere denir. 4/25

Biyobelirteçler • Kan biyobelirteçleri –İGST –Neopterin, Prokalsitonin –TB antikorları –mi. RNA • Nefes biyobelirteçleri –Uçucu organik bileşikler • Balgam biyobelirteçleri –TB antijenleri (MPT 64, Ag 85 v. b. ) –TB-spesifik beta-laktamaz • İdrar biyobelirteçleri –Lipoarabinomannan (LAM) –Transrenal DNA –Adenozin deaminaz, alkalin fosfataz –İFN WHO; Global Tuberculosis Report 2014 5/25

Mikroskobik inceleme Boyama Ehrlich-Ziehl-Neelsen Auramine-Rhodamine Mikroskop Işık mikroskobu Floresan mikroskobu LED mikroskobu • Boyama yöntemlerinin duyarlılığı düşüktür (%40 -60) • Boyalı inceleme ile M. tuberculosis diğer mikobakteri türlerinden ayrılamaz 6/25

Kültür tüberküloz ve tüberküloz dışı mikobakteri enfeksiyonlarının tanısında altın standarttır Löwenstein-Jensen Middlebrook 7 H 10 Otomatize ticari sistemler • Üreme süresi kısaldı (10 -14 gün süre gerekiyor) • Üreme oranları arttı (Üreme için 10 canlı basil yeterli) 7/25

Mikobakteri türlerinin tanımlanması Fenotipik testler Biyokimyasal testler MPT 64 kart test MALDI TOF kütle spektrometresi M. tuberculosis kompleks Tüberküloz dışı mikobakteri • Zaman alıcı • Zahmetli • Yorumlaması güç • Hızlı • Ucuz • TDM türlerini tanımlamıyor • Hızlı • Cihaz pahalı • TDM tanımlaması ? ? • Çok kısa sürede sonuç alınmaktadır 8/25

M. tuberculosis’de ilaç direncinin belirlenmesi ÇİD-TB (MDR-TB) YİD-TB (XDR-TB) TİD-TB (TDR-TB) tüberküloz tedavisinde önemli bir sorun Fenotipik yöntemler Agar proporsiyon MGIT 960 • 2 -3 hafta • 4 -13 gün 9/25

Moleküler yöntemler • Doğrudan klinik örnekten tüberküloz tanısı • Mikobakteri türlerinin tanımlanması • M. tuberculosis’de ilaç direncinin belirlenmesi • 2 -6 saat içinde sonuçlanır • Genotiplendirme 10/25

Doğrudan klinik örnekten tüberküloz tanısı • Klinik örnekte Mycobacterium tuberculosis’e ait genetik materyali (DNA/RNA) saptar Discovery Medicine, 2012 11/25

Gene. Xpert MTB/RIF • Real-time PCR (rpo. B geni çoğaltılır) • Kontaminasyon riski çok azdır • 1. 5 saat içinde MTB ve RİF direnci saptanır • Referans laboratuvar sonuçları ile moleküler testler konusunda deneyimsiz laboratuvarın sonuçları uyumlu Lancet Infect Dis. 2013 ; 13(4): 349 -61, Respirology (2013); 18, 217 -232, J Clin Microbiol. 2010 ; 48(7): 2495 -501 12/25 J Clin Microbiol 2010 ; 48(1): 229 -37, WHO; Global Tuberculosis Report 2012

Gene. Xpert MTB/RIF (Performans) • Akciğer tüberkülozu –Olguların %90’ını saptar (%85&) • Yayma (+) olguların %99’u (%100&) • Yayma (-) olguların %75’i (%74&) Lancet Infect Dis. 2013 ; 13(4): 349 -61 &J Clin Microbiol 2011; 49(12): 4138 -41 • Akciğer dışı tüberküloz – Olguların %77 -80’ini saptar (%67&) • Yayma (+) olguların %100& • Yayma (-) olguların %37 -63& • Duyarlılık daha düşük; – Plevral – Perikardiyal – Peritoneal – Sinovyal sıvılarda 13/25

Gene. Xpert MTB/RIF • Duyarlılık < Sıvı kültür < = Xpert = Katı kültür > Mikroskopi Lancet Infect Dis. 2013 ; 13(4): 349 -61 14/25

Gene. Xpert MTB/RIF (Kısıtlılıklar) • M. tuberculosis kompleks üyelerini ayırmaz • M. tuberculosis • M. bovis BCG • M. caprae • M. pinnipedii • M. microti • M. canettii • M. tuberculosis DNA’sını saptar – Ölü basili canlı basilden ayırmaz – Tedavinin takibinde kullanılamaz • Tübeküloz dışı mikobakterileri saptamaz 15/25

Mikobakteri türlerinin tanımlanması • Bilinen 150’den fazla mikobakteri türü var Moleküler yöntemler tür tanımlamasında altın standarttır 16/25

Mikobakteri türlerinin tanımlanması • Tüberküloz dışı mikobakteri türlerinin tanımlanması • Etken türün saptanması – M. avium – M. intracellulare – M. kansasii – M. abscessus • Yeni türlerin tanımlanması – M. celeriflavum • Yöntemler • PCR-Ters hibridizasyon • DNA dizi analizi • M. tuberculosis kompleks üyelerinin tanımlanması –İnsan tüberkülozu etkeni M. bovis • 2009 -2014; 8 insan izolatı –Aşıya bağlı M. bovis BCG • 15 BCG bovis izolatı • 1 suş RİF dirençli • Yöntemler • PCR-Ters hibridizasyon • Spoligotiplendirme 17/25

M. tuberculosis’de ilaç direncinin belirlenmesi • Dirence yol açan mutasyonlar saptanır • Sorunlar/Kısıtlılıklar • Yanlış duyarlı • RİF direnci rpo. B % >95 • Hedef aldığı bölgenin/genin dışındaki direnç mutasyonlarını saptayamaz • INH direnci kat. G ve inh. A • Etambutol direnci emb. B • Amikasin, kanamisin direnci • Kinolon direnci gyr. A rrs • Yanlış dirençli • Sessiz/nötral mutasyonları saptar TGC T CAC GGA GTA GCG Cys His Gly Val Ala • Yöntemler • PCR-Ters hibridizasyon • DNA dizi analizi 18/25

Genotiplendirme • Karşılaştırılan bakteri suşlarının birbiriyle ilişkisini gösterir • Spoligotiplendirme • MIRU-VNTR Çavuşoğlu C, 2009 -2013 Ege Bölgesi (330 izolat) 1. 53; T 1 (%26) 2. 41; LAM 7 -TUR (%8) 3. 50 ; H 3 (% 6) 4. 284; T 1 (% 5) 5. 4; UNKNOWN (%3) • Laboratuvar içi çapraz bulaş • Kişiler arasında bulaş • Toplum temelli çalışmalar –Bir bölgedeki suşların filocoğrafik dağılımı –Suşların dağılımında yıllar içinde görülen değişim –Dışarıdan gelen yabancı suşların varlığı 19/25

İmmünolojik yöntemler Clemens von Pirquet Robert Koch Tüberkülin • • TDT İGST Özgül hücresel bağışıklık yanıtını araştıran testler Enfeksiyona karşı aşırı duyarlılık reaksiyonunu gösterir Pozitif test kişinin M. tuberculosis ile enfekte olduğunu gösterir. Latent tüberküloz enfeksiyonunu aktif tüberkülozdan ayırmaz 20/25

İGST QFT-GIT (Qiagen) Özgül T hücreleri tarafından salgılanan IFN-γ saptanır • Basit/Rutinde uygulaması kolay T-SPOT. TB (Oxford Immunotec) IFN- salgılayan özgül T lenfositleri saptanır • Zahmetli/Rutinde uygulaması zor • BCG aşısından • TDM enfeksiyonlarından (M. kansasii, M. marinum, M. szulgai hariç) etkilenmezler • Değerlendirmeye bağlı değişken sonuç ve Booster etkisi görülmez 21/25

Quantiferon QFT-TB PPD cellestis >2001 QFT-G ESAT-6 CFP-10 cellestis >2005 QFT-GIT QFT-Gold plus ESAT-6 CFP-10 TB 7. 7 C 4 TH ESAT-6 CFP-10 cellestis>2007; Qiagen>2013 CD 8 TC ESAT-6 CFP-10 Qiagen>2014 22/25

İGST (Performans) QFT-Gold plus QFT-GIT • Duyarlılık • %89 (%83 -84) • Özgüllük • %99. 1 (%99) • Duyarlılık • TB 1 (%93. 6) • TB 2 (%94. 8) • Toplam (%95. 3) • Özgüllük • TB 1 (%98. 8) • TB 2 (%97. 6) • Toplam (%97. 6) T-SPOT. TB • Duyarlılık • %95. 3 (%90 -91) • Özgüllük • %97. 1 (%88) CDC; MMWR; June 25; 2010; Updated Guidelines for Using IGRA’s to Detect M. tuberculosis infection-United States, 2010 23/25 Kaynak: Ürün rehberleri

QFT-GIT (Sorunlar) • Pozitif • M. tuberculosis ile enfekte • Negatif • M. tuberculosis ile enfekte değil • Belirsiz (indeterminate) Belirsiz Sonuçların Olası Nedenleri • Kanın önerilen sıcaklık aralığının (17 -270 C) dışında bekletilmesi • Kan örneklerinin bekletilme süresinin 16 saatten uzun olması • Kan tüplerinin yeterli karıştırılmaması • Dolaşımdaki IFN-γ düzeyinin aşırı yüksek olması veya heterofil antikorların varlığı • Yetersiz lenfosit sayısı veya aktivitesi • <5 yaş çocuklar 24/25

İGST (Ne zaman kullanalım) TDT’nin kullanılmasının önerildiği tüm durumlarda kullanılabilir. MMWR Recomm Rep 2010; 59 (No. RR-5) 1 -25 • Aktif TB gelişme riski yüksek olan LTBE’lilerin saptanmasıda – İmmünsüpresyon • anti-TNF-α, steroid tedavisi • HIV/AIDS, solid organ transplantasyonu v. b. – Temaslı taramasında • Sağlık çalışanlarında • Sistematik LTBE taramasında • Aktif tüberküloz tanısında kullanım endikasyonu yoktur ? ? WHO; Global Tuberculosis Report 2014 25/25