Microscopie Colorations Diffrentielles 1 Coloration de Gram 2

Microscopie Colorations Différentielles 1

Coloration de Gram 2 • Divise les bactéries en deux groupes en fonction de la composition de la paroi cellulaire • Gram Negatives & Gram Positives Rouge Mauve

Coloration de Gram - Principe 3 • Utilise une combinaison de deux colorants • Coloration primaire - Cristal violet • Mauve • Coloration secondaire – Safranine • Rouge • Gram positif • La paroi permet de piéger le 1 er colorant • Gram négatif • La paroi ne permet pas de piéger le 1 er colorant

Paroi Cellulaire 4

Méthode - Coloration Primaire 5 1. Coloration avec cristal violet + 2. Ajout de l’iode de Gram (Mordant) + + + Paroi: peptidoglycan Membrane plasmique + + + LPS -------Gram positive -------Gram négative

Méthode – Étape Différentielle 6 3. Lavage à l’alcool Paroi est déshydraté et moins perméable – Complexe colorant + iode est piégé Paoi: peptidoglycan Membrane plasmique Couche LPS est dissoute Paroi est déshydraté, mais perméable – Complexe n’est pas piégé LPS - -+ - +- -+- Gram positive - -+ - +- - +- Gram négative

Méthode – Contre Coloration 7 4. Coloration avec la Safranine + + + + Paoi: peptidoglycan Membrane plasmique + + + + LPS - -+ - +- -+- Gram positive -------Gram negative

Sommaire 8 Fixation Coloration primaire Cristal violet Lavage Décoloration Contre coloration Safranine

Gram Positif 9 • Colorées Mauves • G + C faible • Bacille ou bâtonnet • Sporulants: Genres Bacillus et Clostridium • Non sporulants: Lactobacillus et Listeria • Coccus ou sphère • Genres Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

Gram Négatif • Colorées Rouges • Protéobactéries, Bactéroïdes, Chlamydia, Spirochètes, Cyanobactéries, bactéries vertes/pourpre sulfureuses, etc. • Majoritairement des bacilles • Quelques genres sont des cocci: • Genres Neisseria, Moraxella, & Acinetobacter 10

Coloration Acido Résistante 11 • Coloration diagnostique de Mycobactérium • Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre • Paroi cellulaire avec acide mycoïque

Méthode 12 • Principe: • Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, acide mycoïque, rend ces bactéries très imperméables aux colorants

Méthode (Suite) 13 • La paroi est rendue perméable par la chaleur • Coloration avec de la fuchsine basique • Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable • Colorant est piégé • Lavage avec de l’alcool acide • Étape différentielle • Mycobactéries retiennent le colorant • Autres bactéries perdent le colorant

Coloration de Spores 14 • Spores: • Cellule bactérienne différentiée • Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques • Typique des bacilles Gram positifs • Genres Bacillus et Clostridium • Conditions défavorables induisent la sporogénèse • Différenciation de cellule végétative à l’endospore

Coloration au Vert de Malachite Sporangium Spores Cellule végétative Endospore • Perméabilisation des spores par la chaleur • Coloration primaire au vert de malachite • Lavage • Contre coloration à la safranine 15

Croissance Bactérienne 16

Croissance Bactérienne 17 • Augmentation du nombre de cellules • La bactérie se reproduit par fission binaire • (1 2, 2 4…. 2 n) • Les mesures de la croissance représentent des suivis des changements dans le nombre total de cellules ou de la masse des cellules

Profil de Croissance Exponentielle l Log 10 du nombre de cellules Latence Inoculation (Temps= 0) Temps 18 Stationnaire Mortalité

Phase de Latence ou d’Adaptation 19 • Aucune augmentation dans le nombre ou la masse de cellules • Synthèses de composantes requises pour la croissance dans un milieu donné • Adaptation métabolique

Phase Exponentielle 20 • Développement et division cellulaire à vitesse maximale • Le nombre et la masse cellulaire doublent à des intervalles réguliers • Population en équilibre physiologique et biochimique • Nombre et la masse de cellules augmente par un facteur exponentiel (2 n) • n = nombre de division ou de générations

Division Exponentielle 21 1 er doublement 2 e doublement 3 e doublement 4 e doublement Nb final de cellules (N) = nombre initial de cellules (N 0) X (2 n) n = nombre de générations

Paramètres de Croissance Logarithmique 22 • Temps de génération: g • Temps requis pour que la densité cellulaire double • g = Δt/n • Constante du taux de croissance: k • Nombre de fois que la densité cellulaire double dans une heure • k = n/Δt (Générations/heures)

Paramètres de Croissance Logarithmique 23 • Taux de croissance: µ • Taux auquel la densité cellulaire change en fonction du temps • µ = ln 2/g (cellules/minute) • Nombre de division : n • Nombre de fois que la densité cellulaire double • N = No (2 n)

Calcul 24 • Après 4 h de croissance une culture d’E. coli passe de 100 cellules à 6. 6 X 106 cellules • Quel était n pour la période de 4 h? • Quel est le temps de génération? • Quel est la constante du taux de croissance? • Quel est le taux de croissance?

Calcul 25 • Après 4 h de croissance une culture d’E. coli passe de 100 cellules à 6. 6 X 106 cellules • Quel est la constante du taux de croissance? • k = n/Δt; k = 16/4 h = 4 • Quel est le taux de croissance? • µ = ln 2/g; µ = ln 2/15 min. ; µ = 0. 69/15 min. • = 0. 046 cellule/min.

Calcul 26 • E. coli a un temps de génération de 20 minutes. Si vous commencez avec 1 cellule d’E. coli combien en aurez-vous après 5 heures? • No: 1; t: 300 min. ; g: 20 min. • n= t/g; n= 300/20 = 15 • N = No(2 n); N = 1 (215); N= 32768

Paramètres de Croissance à Partir d’un Graphique 27 Tous les paramètres de croissance doivent être déterminés à partir de la phase logarithmique! Dans ce cas, entre 40 -190 min.

Lecture d’une Échelle Logarithmique 1 23456 78 106 28 Quelle est cette valeur? 9 107 108 109

Déterminer le Temps de Génération 29 Méthode 1: • Choisir deux points qui représentent un doublement du nombre de cellules • Ex. 10 et 20 • Déterminer l’écart de temps g Méthode 2: • Choisir n’importe quel deuxpoints et déterminer les coordonnés. (Nombre de cellule et temps) • Calculer n pour l’écart de temps • Calculer g: Δt/n

Phase Stationnaire 30 • Arrêt de la croissance cellulaire • Population n’est plus en équilibre • Arrêt en raison d’un manque de nutriments, d’oxygène ou à une accumulation excessive de déchets, etc. • Représente le rendement de croissance maximal sous les conditions données • Yg : Masse de microorganismes formés/Masse (g) de substrat consommé • Ym: Masse de microorganismes formés/mole de substrat consommé

Phase de Mortalité 31 • Perte de viabilité exponentielle en raison d’un manque de nutriments ou d’une exposition prolongée à des déchets • Pas nécessairement une perte de masse

Fermentation 32

Pourquoi la Fermentation? 33 • Fermentation: Métabolisme énergétique cellulaire fait en absence d’oxygène (anaérobie) • Les levures sont souvent utilisées comme fermenteurs • Elles consomment des sucres pour la libération d'énergie et des sous-produits tels que l'éthanol et du dioxyde de carbone

Composantes de la Fermentation 34 • La fermentation comporte. . . • Substrats - habituellement un sucre • Produit - la substance créée (éthanol) • La fermentation nécessite un organisme qui peut utiliser des substrats en absence d'oxygène

Oxydation du Glucose en Acide ou Éthanol • Glycolyse: • Oxydation partielle du glucose au pyruvate • Production nette de 2 ATP • 2 NAD sont réduits au NADH • NAD est régénéré par la fermentation • Capteur d’électrons organique 35

Fermentation Industrielle 36