Microscopa y tcnicas de estudio a nivel celular

Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular

Microscopía àCampo claro àCampo Oscuro Ópticos àContraste de fase àConfocal Tipos de microscopios àFluorescencia Electrónicos àTransmisión àBarrido

Algunos Conceptos… Magnificación Aumento que logra el equipo Resolución (D) Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0, 5. λ D= n. senθ ¿Cómo disminuir D?

Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? D= 0, 5. λ n. senθ Longitud de onda del haz de luz FILTRO AZUL

Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? D= 0, 5. λ n. senθ Objetivo q LENTE CON AN MAYOR muestra

Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? D= 0, 5. λ n. senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. n. Aire: 1 n. Aceite: 1, 5

Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS

Microscopio óptico

Microscopio óptico - Campo claro Eosinofilia

Microscopio óptico - Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción

Microscopio óptico - Campo oscuro Treponema pallidum

Microscopio óptico - Contraste de fase Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

Microscopio óptico - Contraste de fase

Microscopio óptico - Contraste de fase Células He. La (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae

Microscopio óptico - Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

Microscopio óptico - Contraste de fase e interferencia Contraste de fase Interferencia diferencial

Microscopio óptico - Fluorescencia Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo Restringe infrarrojo

Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria

Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Bacilos en división Mitocondria 60. 000 x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM) Glomérulo renal 1200 x Célula en corte transversal Espermatozoides bovinos Piel humana

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM) Bacterias sobre un estoma Glób. Blanco Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo

Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas L Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. L Altos costos de procesamiento de las muestras L La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. L Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos L La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. J Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

Técnicas inmunológicas

Técnicas inmunológicas Introducción a las Técnicas inmunológicas üELISA üWestern blot üInmunohistoquímica üInmunofluorescencia üCitometría de flujo

Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Anticuerpo epitope Antígeno Linfocito B Activación

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales Antigeno Activación Linfocitos B

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales Sangre Centrifugación Suero Purificación

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Antígeno Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Para detectar Anticuerpos Antígenos

ELISA Para detectar Anticuerpos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA Para detectar Anticuerpos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA Para detectar Antígenos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA Para detectar Antígenos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA

Técnicas inmunológicas - Detección indirecta

Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina Biotina Avidina

Técnicas inmunológicas - Detección indirecta Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo

Western blot SDS PAGE Gel Transferencia Membrana

Western blot Bloqueo Avidina-peroxidasa Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Revelado • Sustrato coloreado que precipita al reaccinar • Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima

Inmunohistoquímica Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Trozo de tejido Anticuerpo 1º Avidina-peroxidasa Anticuerpo 2º biotinilado Revelado

Inmunohistoquímica - Sustratos

Inmunohistoquímica - Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

Inmunofluorescencia Fluoresceina Rodamina DAPI Bromuro de Etidio Naranja de Acridina Ficoeritrina

Inmunofluorescencia Rat neurons N-myc/CD 56

Inmunofluorescencia - colocalización La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

Inmunofluorescencia - colocalización

Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática

Citometría de Flujo Marcación con anticuerpos monoclonales Mezcla de células

Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una

Citometría de Flujo Columna de células

Citometría de Flujo Laser Detector

Citometría de Flujo Granularidad La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc) Tamaño La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

Citometría de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea Granulocitos SSC Linfocitos Monocitos RBCs, debris, Células muertas FSC

Cuentas Citometría de Flujo - Histograma Intensidad de fluorescencia

FL 2 Citometría de Flujo - Dot Plot FL 1

Citometría de Flujo - Dot Plot

Citometría de Flujo - Cell sorting

Citometría de Flujo

Citometría de Flujo