MICROBIOLOGA Medios de cultivo MEDIOS DE CULTIVO El
MICROBIOLOGÍA
Medios de cultivo
MEDIOS DE CULTIVO El material alimenticio en donde crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo.
Condiciones de un medio de cultivo Ø Temperatura. Ø Grado de humedad. Ø Presión de oxígeno adecuadas. Ø Grado correcto de acidez o alcalinidad. Ø Excento de todo microorganismo contaminante.
Clasificación en base a su estado físico Líquidos Sólidos Semisólidos
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Medios líquidos. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1. 5%. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0. 7%.
Clasificacion en base a su composición: • A. Medios sintéticos o químicamente definidos. B. Medios complejos o de composición indefinida. C. Medios de enriquecimiento. D. Medios selectivos. E. Medios diferenciales. F. Medios de mantenimiento.
A. - Medios sintéticos o químicamente definidos. • Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que sustituyan iones (P, K, Mg, Fe, Ca. . . ), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
B. Medios complejos o de composición indefinida. • Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
C. Medios de enriquecimiento. • Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D. Medios selectivos. • Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO 2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
E. Medios diferenciales. • Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; Mc. Conkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F. Medios de mantenimiento. • Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN CULTIVO PURO • Un cultivo puro es aquel formado por células provenientes de una sóla inicial y por tanto pertenecientes a la misma especie y cepa. Es una situación artificial ya que en la Naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas y heterogéneas
1. - Métodos para aislar cultivos puros • i. - Técnica de siembra por estrías en placa. ii. - Técnica de vertido en placa. iii. - Técnica de enriquecimiento del cultivo: consiste en diseñar condiciones de cultivo que favorezcan específicamente al microorganismo queremos aislar y que se encuentra en pequeñas cantidades. iv. - Técnica de las diluciones en serie: se utiliza para microorganismos cuya proporción es mayoritaria dentro de la población mixta. v. - Técnica de aislamiento de una sola célula mediante un micromanipulador.
2. Mantenimiento y preservación de cultivos puros • i. - Resiembra periódica en medios frescos. ii. - Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral. iii. - Liofilización iv. - Almacenamiento a temperaturas muy bajas en presencia de agentes estabilizantes como glicerol o dimetilsulfóxido. Nitrógeno líquido (196° C).
3. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS • 1) Siembra por estría en superficie: Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Esto puede realizarse de varias formas:
• A) Al comienzo se descarga la mayor cantidad posible de material, luego se continúa con la estría. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres cajas, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material
• B) Se puede dividir la caja en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas
• C) El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente hasta cinco veces
• 2) Siembra por dilución: Se toman tres tubos de ensayo con medio agarificado, los cuales se funden y mantienen a baño María (45ºC) para que no solidifiquen. Se toma el material a aislar y se siembra en el primer tubo, se agita bien; de este tubo se toma material y se siembra en el segundo tubo y se repite lo mismo en el tercer tubo. Luego son volcados en distintas cajas de Petri, se deja solidificar y se coloca en estufa a incubar. En la estufa, las cajas de Petri son colocadas en forma invertida a fin de evitar que el agua de condensación que se forma en las tapas caiga sobre el cultivo
• 3) Siembra por extensión en superficie: Se coloca una gota del material a aislar en el centro de la caja de Petri y de allí se extiende por toda la superficie con la espátula de Drigalsky. Se puede repetir esta operación en otra caja con la misma espátula sin tomar nuevo material, con lo cual se obtendrán colonias bien separadas unas de otras
• 4) Siembra en tubos de ensayo: Los tubos de ensayo son menos empleados que las cajas debido a que ofrecen poca superficie de siembra y es difícil aislar las colonias del interior de los mismos. Se emplean para microorganismos que pueden ser separados en medios específicos donde las otras especies no progresan o lo hacen lentamente.
• a- Por estría: Se utilizan tubos de ensayo con medio de cultivo solidificado en forma inclinada (pico de flauta) para así aumentar la superficie se siembra. Con el asa se toma el material a sembrar y se lo introduce en el fondo del mismo, luego se hace la estría desde el fondo hacia arriba en toda la superficie
• b- Por picadura o punción: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio solidificado en forma vertical. Con sólo soltar la aguja, ésta se introduce por su propio peso en el medio de cultivo, formando un canal de punción. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente al oxígeno
Tinción Gram Material • Microscopio • Portaobjetos • Cubreobjetos • Asa de siembra • Cultivo bacteriano • Pinzas • Mechero • Cristal violeta • Lugol • Alcohol-acetona • Safranina
• Tinción Gram • • • REALIZACIÓN Preparar los frotis bacterianos. Teñir con cristal violeta 1 min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1 min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30 seg) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teñir con safranina 1 min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparación. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.
• Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro.
Cultivo mixto Bacterias Gram + Bacterias Gram -
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