Microbiologa General Seminario Nro 1 Esterilizacin y Bioseguridad

Microbiología General Seminario Nro. 1 Esterilización y Bioseguridad

Algunos conceptos básicos. . . ·Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia. ·Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias ·Bacteriostático: Agentes que inhiben el crecimiento de las bacterias ·Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo. · Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas

Esterilización Criterio de muerte para un microorganismo Perdida irreversible de su capacidad de reproducción

Cinética de Muerte de un MO La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética exponencial. Nº ufc d. N dt tiempo = - K´N

Cinética de Muerte de un MO

VALOR D : Tiempo de reducción decimal Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.

VALOR D : Tiempo de reducción decimal

log nº m. o. viables Efecto de la Temperatura 100 50 ºC ¿ A que temperatura es menor el valor de D? 10 70 ºC 60 ºC 1 tiempo

log nº MO viables D es un parámetro de la sensibilidad de un Microorganismo determinado al efecto de la temperatura 100 10 1 A ¿Cuál es el MO más sensible al tratamiento? B C tiempo

VALOR Z Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial. donde ∆T es el incremento de temperatura, y DT 1 y DT 2 los valores de D a las dos temperaturas estudiadas.

Efecto de la Temperatura sobre características de los alimentos

Efecto de la carga inicial (No)

Esterilización en Microbiología de Alimentos Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un tratamiento 12 D de los productos susceptibles de ser portadores de gérmenes patógenos (o que puedan dar lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 órdenes de magnitud el número de supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de 10 -12 la probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos que un solo microorganismo contaminaba unidad (una lata, por ejemplo) del alimento inicial, después de un tratamiento 12 D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se reduce hasta 10 -12.

Clostridium botulinum D 121 = 0. 20 min 3. 5 x 10 15 ufc/ lata No = 3. 5 x 10 5 ufc/lata Tiempo de tratamiento a 121°C = 2 min NF = ¿?

6 Valor D=1 minuto 105 5 4 3 B 2 A 1 0 0 1 2 3 4 Tiempo (min) 5 6 7 1 2 3 4 5 6 Log 10 Probabilidad de sobrevivientes Recuento de viables Log 10

12 10 8 6 4 MO A 2 D=1 min a 121 ºC 0 0 MO B 1 D=0. 5 min a 121 ºC 2 3 4 5 6 Tiempo (min) 7 2 4 6 8 10 12 Log 10 Probabilidad de sobrevivientes Recuento de viables Log 10

Ejercicios – Si se ha determinado que para esporas de Clostridium botulinum suspendidas en buffer fosfato el D 121 = 0. 204 min, ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121°C? – Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10ºC. ¿Cuánto tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111°C? – La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento tiene una carga bacteriana de 4 x 105 ufc/ml. La leche se va a procesar a 79ºC por 21 segundos. Si el valor D promedio para la población bacteriana a 65ºC es de 21 segundos y el valor Z es de 7ºC, cuántos microorganismos quedarán luego del tratamiento a 79ºC? ¿Cuánto tiempo se requeriría para lograr el mismo grado de letalidad a 65ºC? ¿Cuánto tiempo llevaría reducir la concentración a 1 ufc/100 ml con un tratamiento a 65ºC?

Agentes Físicos • CALOR • RADIACIONES • FILTRACIÓN

Calor • Calor húmedo Ambos pueden ser utilizados en procesos de esterilización • Calor seco

Calor húmedo PROCESOS • Esterilización: ü Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica ü Tindalización (fraccionada por vapor) • Pasteurización • UHT MECANISMOS DE ACCIÓN • Desnaturalización de proteínas • Destrucción de ácidos nucleicos

Pasteurización • LHT (low temperature holding) 30 minutos a 62. 8ºC • HTST (high temperature short time) 15 segundos a 71. 6ºC • Solo destruye patógenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium tuberculosis, etc. ) y reduce flora de deterioro. NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN • Usos: leche, lácteos, jugos de fruta Louis Pasteur

UHT (Ultra high temperature) • 140ºC-150ºC durante pocos segundos • Proceso continuo • Necesita envasado aséptico • Si es un proceso de esterilización

Tindalización • 100 ºC 30 min, 3 días sucesivos • Proceso discontinuo con períodos de incubación intercalados • Usos: esterilización de productos de baja resistencia térmica, cuando no existe otra opción John Tyndall

Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica • Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de 100ºC (PRECAUCIÓN: eliminación total del aire) • Equipo: Autoclave • Alcance: Se puede conseguir esterilización • Usos: Esterilización de materiales y productos termoestables ( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminación de desechos biológicos.

Autoclave

Autoclave Condiciones : • 121ºC durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas • 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales altas Indicadores: • Físicos: Temperatura y/o presión • Químicos • Indicador biológico: Geobacillus stearotermophilus (D 121ºC=1. 5 minutos) Tamaño del inóculo: 104 esporas

Temperatura ºC Perfil de temperatura de un proceso de esterilización por calor húmedo 120 110 1 2 3 100 Tiempo (min. ) 15 Etapa de mantenimiento Etapa de calentamiento Etapa de enfriamiento

Calor Seco • Mecanismo de acción: Procesos de oxidación • Controles de proceso de esterilización Indicadores físicos y químicos Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis var. niger (D 160ºC = 0. 3 a 1. 8 min, Z=20ºC, tamaño del inóculo: 105 esporas)

Calor Seco Aire caliente: Equipo: Hornos eléctricos Alcance: Se consigue esterilización (170ºC, 60 minutos o 160ºC, 120 minutos) Usos: a) Esterilización de: • Materiales resistentes al calor • Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas, vaselina líquida) • Polvos b) Despirogenizacion (250ºC 45 minutos o 180ºC 4 hs, o 650 1 min)

• Incineración: Destrucción de material contaminado Flameado : Desinfección

Resistencia a calor RESISTENCIA ü Priones ü Endosporas bacterianas ü Mycobacteria ü Virus sin envoltura lipídica ü Hongos ü Bacterias ü Virus con envoltura lipídica + _

Esterilización por filtración La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros medicamentos, etc.

Filtros de profundidad: Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes. Filtros de superficie: Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través de ellos es lenta. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo.

FILTRACIÓN DE AIRE • Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) • Remoción de hasta el 99. 97% de partículas mayores de 0. 3 micrones de diámetro • Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar CONTROL • Retención Mínima de un 99. 97% de partículas generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un diámetro de 0. 3 micrones. SE USAN PARA Lograr ambientes con número de partículas controlado: FLUJOS LAMINARES AREAS DE TRABAJO

Cabinas de Flujo Laminar Vertical Salida de aire Entrada de aire Protege la muestra, el operador y el medio ambiente

Esterilización por radiaciones Baja energía Actividad antimicrobiana Alta energía Dos tipos: Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes

Radiaciones Ionizantes Características: • Alta energía, baja longitud de onda • Gran poder de penetración • Ionizan átomos y moléculas • No requieren altas temperaturas Tipos: • Rayos gamma (60 Co o 137 Cs) • Rayos catódicos (electrones acelerados) • Partículas beta

Mecanismos de acción: • Formación de radicales libres • Daño al ADN, ARN Resistencia: Priones Deinococcus radiodurans Enterococcus faecium Esporas bacterianas Virus Hongos Bacterias (en gral) D (k. Gy) 3 1. 2 m. o. Bacillus pumilus Staphylococcus spp.

Desventajas: Equipo especial, personal entrenado No todos los materiales resisten el tratamiento Reacciones no deseadas en alimentos

Radiaciones no Ionizantes Características: • Baja energía, sin poder ionizante • Sin poder penetrante • Máxima eficiencia biocida a 260 nm Mecanismos de acción: • Sitio blanco ADN • Formación de dímeros de timina Usos: • Desinfección de superficies • Desinfección de aire y agua NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA:

ESTERILIZACIÓN Luz ultravioleta POR RADIACION UV La radiación ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por más de 30 años. La acción de los rayos ultravioleta se debe a la producción de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución de 1 x 40. 000. Los aminoácidos aromáticos de las proteínas y las bases puricas y primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto blancos afectados por la acción bactericida de la acción ultravioleta. Evitando la replicación de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en mutaciones mortales. Dímeros de timina

Procesos de esterilización Agente Condiciones Usos Calor húmedo 121ºC 15 min. (o equivalente) Material termoestable Penetrable por vapor Calor seco 160ºC 2 horas 180ºC 1 hora Material termoestable No penetrable por vapor Radiaciones ionizantes 25 KGy 45 KGy Material termosensible Resistente al tratamiento Filtración 0. 22 micras de poro Material filtrable

Control de Esterilización • Controles del proceso Indicadores: Físicos Químicos Biológicos • Post-proceso: TEST DE ESTERILIDAD !!!

Controles del proceso Indicador físico Indicador químico Indicador biológico Ej: Temperatura, presión Cambio de color Microorganismo resistente

Agentes químicos de esterilización y control del crecimiento Antisépticos Alcoholes Iodo Órgano-Mercuriales Colorantes Desinfectantes y/o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados Aldehídos Oxido de Etileno Compuestos Fenólicos

Alcoholes • Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas. Desorganizan la estructura fosfolipídica de la membrana. • No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. • Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. • Los más utilizados son el etanol e isopropílico. Iodo • Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc. • Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. • Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre

Peróxido de Hidrógeno • Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres. • Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biológicos debido a que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído. Órgano-Mercuriales • Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas. • Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate.

Colorantes Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámico en UDPacetilmuramil-péptido. R = HSO 4 - Verde Brillante R = Cl- Verde de Malaquita Violeta de Genciana

Cloro y sus derivados El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina. El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, esporas y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HCl. O) y al Cl 2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50 -100 g/l de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del 0. 1 -0. 5% de Cloro activo. Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica

Aldehídos • Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática. • Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. • El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío. • El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. • El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados. Glutaraldehido Paraformaldehido Formaldehido

Oxido de Etileno • Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. • Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso

Compuestos Fenólicos • Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. • El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido queda luego de tratar las superficies. • Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas. Coeficiente del fenol

BIOSEGURIDAD

Bioseguridad • Contención primaria: protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos. • Contención secundaria: Protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos • Equipos de Seguridad (Barreras Primarias). Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos. • Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias) • Riesgo Biológico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, o toxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos.

Bioseguridad Niveles de Bioseguridad

Bioseguridad Agentes de Riesgo Se entiende por agente de riesgo biológico cualquier microorganismo -incluyendo de los genéticamente modificados- cultivo celular, animal o planta o producto de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres vivos.

Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo I Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos sanos y existe un potencial mínimo de peligro para el personal del laboratorio y el ambiente. Bacillus subtillis Naegleria gruberi virus de la hepatitis canina infecciosa

Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo II Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestión o exposición percutánea o mucosa. Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos animales pero es poco probable que sea un problema para los trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las medidas preventivas están disponibles, el riesgo de dispersión de la enfermedad es limitado. Salmonella spp. Virus de la Hepatitis B Toxoplasma spp. Bacillus anthracis Bordetella pertussis

Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo III Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de transmisión por aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal. Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y humanos pero que comúnmente no se propagan de un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo están disponibles. Brucella bortus Coxiella burnetii Mycobacterium

Bioseguridad Agentes de Riesgo - Grupo IV Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o que se desconoce su riesgo de transmisión. Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no están disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo. Virus de Marburg Ebola Virus Junín

Bioseguridad Gabinetes de seguridad biológica Clase I (Campana) B. Ventana A. Apertura frontal C. Filtro de Escape HEPA D. Pleno de Escape

Bioseguridad Gabinetes de seguridad biológica Clase II (Flujo Laminar) A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de Presión Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA adicional para enviar aire. A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de escape HEPA; D. Pleno posterior; E. Filtro HEPA de Suministro; F. Ventilador

Bioseguridad Gabinetes de seguridad biológica Clase III (Flujo Laminar) A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes del largo del brazo al gabinete; B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D. Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.

Bioseguridad Transporte de material riesgoso