Microarranjos de DNA Karine Begnini MICROARRANJOS DE DNA

Microarranjos de DNA Karine Begnini

MICROARRANJOS DE DNA Técnica que utiliza fragmentos de DNA fixados à uma superfície sólida, no qual as amostras são hibridizados para analisar a expressão de genes simultaneamente ou genotipar regiões de interesse do genoma Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada

MICROARRANJOS DE DNA Spots de DNA: sequências conhecidas de DNA de interesse (probes). Tamanho de ~100 µm de diâmetro DNA, t. RNA ou c. DNA

MICROARRANJOS DE DNA

Década de 80: Edwin Southern desenvolveu e patenteou a técnica 1991: Cientistas desenvolvem os de DNA da Affymax primeiros chips 1993: Affymetrix: desenvolvimento de chips 1994: Primeiras coleções de c. DNA 1995: Expressão gênica Chips em laboratório 1996: Testes e comercialização dos chips Francis Collins – mutações BRCA 1 – câncer de mama Construção de chips com muitos genes (6000 genes de levedura)

UTILIZAÇÕES • • Análise de expressão Genotipagem de SNP Detecção/caracterização patógenos Sequênciamentos Identificação de inserções Análise de metilação de DNA Estudos de interação proteína/DNA

UTILIZAÇÕES Por que usar Microarray para análise de expressão? • Análises de expressão convencionais somente permite o estudo de um ou poucos genes em um experimento • Permite o estudo da expressão de milhares de genes em um único experimento • Permite a análise da expressão global de genes o que não é possível em técnicas convencionais

Microarray x Outras técnicas Southern blot Control Cells RNA Microarray Treated Cells RNA Control Cells RNA Label with Cy 3 Treated Cells RNA Label with Cy 5 Electrophoresis and Blotting Hybridization Hybridize, wash, and scan Labeled probe – gene “X” Microarray containing 16 probes

Microarray x Outras técnicas Microarray PCR em tempo real Control Cells RNA Label with Cy 3 Treated Cells RNA Label with Cy 5 Hybridize, wash, and scan Microarray containing 16 probes

Tipos de Microarranjos Spotted Arrays • Homemade • Desenhado • Máximo de 24. 000 análises por experimento • Susceptível a variabilidade Affymetrix Arrays • Disponível comercialmente • Definido anteriormente • Máximo de 500. 000 análises por experimento • Menos variável

Experimentação 1. Obtenção da amostra (DNA/RNA) 2. Método de detecção (corantes) 3. Leitura

Obtenção da amostra (DNA/RNA) RNA – c. DNA • Métodos de extração: * Trizol ou outros métodos similares * Livre de proteína, de DNA e de inibidores

Obtenção da amostra (RNA) CUIDADOS: • Possibilidade de presença de DNA genômico ou proteínas contaminando as preparações de RNA- falso positivo • RNA é um material bastante sensível e exige cuidados especiais de manipulação e armazenamento. DNA A 260/280 é ~1. 8 RNA A 260/280 é ~2

Síntese de c. DNA

Preparo da amostra

Corantes • Cianinas sintéticas • Cy 3 fluorescência verde • Cy 5 fluorescência vermelha

Leitura • O laser escaneia o array e produz imagens • Um laser para cada cor (um para verde, outro para vermelho) • Análise da imagem: – Supressão de background – Localização e detecção dos spots, incluindo a redução da intensidade de background, posição do spot e tamanho deste.

Leitura • Dados apresentados em escala de cor – Verde: reprimido (menos m. RNA) – Vermelho = induzido (mais m. RNA) – Preto = sem mudança (1: 1 ratio) • Somente usada razão - Valores <1 (reprimido) - Valores >1 (induzido)

Leitura – Fold induction – quantas vezes – Expressão como repressão ou indução (Y-fold) – Calculado como o inverso da razão • Razão de 0. 33 = repressão 3 -fold • Razão de 10 = indução de 10 -fold

Leitura Block Column Row Gene Name Red Green Red: Green Ratio 1 1 1 tub 1 2, 345 2, 467 0. 95 1 1 2 tub 2 3, 589 2, 158 1. 66 1 1 3 sec 1 4, 109 1, 469 2. 80 1 1 4 sec 2 1, 500 3, 589 0. 42 1 1 5 sec 3 1, 246 1, 258 0. 99 1 1 6 act 1 1, 937 2, 104 0. 92 1 1 7 act 2 2, 561 1, 562 1. 64 1 1 8 fus 1 2, 962 3, 012 0. 98 1 1 9 idp 2 3, 585 1, 209 2. 97 1 1 10 idp 1 2, 796 1, 005 2. 78 1 1 11 idh 1 2, 170 4, 245 0. 51 1 1 12 idh 2 1, 896 2, 996 0. 63 1 1 13 erd 1 1, 023 3, 354 0. 31 1 1 14 erd 2 1, 698 2, 896 0. 59

Real DNA Microarray

Exemplos Amostras de células tratados composto X

Exemplos Expressão de genoma viral ao longo de determinado intervalo de tempo

Exercício 1 Paciente A: tem 5 genes (A 2, A 3, B 1, B 3, C 4) que são muito ativos na ALL. Os outros genes são controles que não nos fornecem informação sobre o tipo de câncer. Podemos assim concluir que este paciente sofre de ALL. Paciente B: tem 2 genes (A 4, B 2) que são altamente expressos na AML. Os outros genes presentes são controles. Como dos 10 genes que normalmente estão ativos na AML, só dois estão ativos neste paciente, não podemos concluir se tem AML ou ALL. Pode ter outro tipo de câncer ou por exemplo estar no início de AML. Doente C: tem 6 genes (A 1, A 4, B 2, C 3, D 2, D 3) que são muito ativos nos tecidos com AML. Os outros genes são controles. Este paciente sofre provavelmente de AML.