MHENDSLK FAKLTES GIDA MHENDSL BLM GMB 311 Enstrmental

MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ GMB 311 -Enstrümental Gıda Analizleri Prof. Dr. İlkay KOCA

Kolorimetre, spektrofotometre GMB 311 -Enstrümental Gıda Analizleri 4. Hafta

• KOLORİMETRELER

• Konsantrasyonu bilinmeyen renkli bir maddenin konsantrasyonunun, aynı maddenin konsantrasyonu bilinen bir sıra çözeltisi ile karşılaştırılıp tayin edilmesi işlemine kolorimetrik analiz ve bu amaçla kullanılan aletlere de kolorimetre denilir.

• Bu metotta sadece doğal renkli maddeler değil, sonradan renklendirilebilen maddeler de tayin edilebilmektedir. Konsantrasyon hesabı ise, rengi aynı veya birbirine eşit olanın konsantrasyonu da birine eşittir prensibinden yaralanılarak ve aşağıdaki eşitlikten hareket edilerek yapılabilmektedir. • A 1 = A 2 • A = εbc (11) veya

εb 1 c 1 = εb 1 c 1 ise ε aynı olduğu için, • b 1 c 1 = b 2 c 2 eşitliği de doğru olur. (16) b 1: referans sıvısı için belirlenen (tabaka kalınlığı) mesafe, b 2: örnek sıvısı için belirlenen (tabaka kalınlığı) mesafe, c 1: referans madde konsantrasyonu, c 2: örnek konsantrasyonu,

KOLORİMETRİK ANALİZLERDE KULLANILAN ALETLER

• Bugüne kadar bir çok değişik kolorimetre cihazı geliştirilmiştir. • Bunlar, çok basit ve elle idare edilen sistemler olabildiği gibi çok daha gelişmiş modern cihazlar şeklinde de olabilir. • Örneğin, son yıllarda; polarimetre, refraktometre ve kolorimetrenin bir arada kullanıldığı kombine enstrümantal analiz sistemleri geliştirilmiş olup halen bir çok amaçla kullanılmaktadırlar.

• Genel olarak kolorimetrelerde; miliabsorbance unit (mau) birimi kullanılır ve bu değer 1 -1000 arasında değişir. • Bu aletlerin hassasiyet sınırı, 1 mau civarındadır. • Ayrıca, kolorimetrelerde kullanılan ışın dalga boyu, 420 -720 nm arasında değişmektedir.

• 2. FOTOELEKTRİK KOLORİMETRE

Bu aletlerde esas olarak ışın şiddeti ölçüldüğü için bunlara fotometre de denir. Fotoelektrik kolorimetrelerle görünür spektrumun belli bir bölgesindeki ışığı absorbe eden çözeltinin renk şiddeti direkt olarak ölçülür.

• Bu metot ile IR ve UV bölgelerinde de çeşitli ölçümlerin yapılabileceği bildirilmektedir. • Bu tür aletlerde üzerine düşen ışını elektrik akımına dönüştüren bir fotosel-fototüp vardır ve akım çok hassas bir miliamperometre ile ölçülür. • Tabii olarak insan gözünün görmediği ışınları algılayabilen ve insan gözünden çok daha hassas fototüpler yapılmıştır.

• Ayrıca, burada çeşitli filtreler kullanılarak sadece istenilen dalga boyuna sahip ışınlar elde edilip örnek üzerine gönderilmektedir.

• Örneğin kırmızı bir madde için mavi filtre, mavi bir madde için kırmızı bir filtre, gri bir madde için ise yeşil bir filtre kullanılması tavsiye edilebilir. Bu tür aletler, modern spektrofotometrelere bir geçiş sağlar. Visuel kolorimetreden daha gelişmiştir.

• Burada yapılan temel işlem, renkli bileşiklerin veya sonradan renklendirilen bileşiklerin konsantrasyonlarının tayin edilmesidir. Bu cihazlarla yine standart eğri metodu veya formül metotları kullanılarak bazı hesaplamalar da yapılabilir.

• KOLORİMETRELERİN KULLANIM ALANLARI

Herhangi bir laboratuvarda rutin analizlerin yapımında veya çok pahalı spektrofotometrelerin alınmasına ihtiyaç duyulmadığı durumlarda kolorimetreler tercih edilmektedir. Son yıllarda çok daha kompleks ve modern kolorimetreler geliştirilmiş olup tıp, biyoloji, çevre ve gıda mühendisliği gibi bir çok alanda kullanılabileceği bildirilmiştir.

Örneğin, kolorimetre kullanılarak • serum analizleri, • alkol fermantasyonlarının takibi ve analizleri, • yağlarda kalite kontrol analizleri ve sınıflandırılmaları, • biyojenik amin, • nitrat ve nitrit analizleri ile • UHT ve bazı sterilize süt ve bileşenlerinin (laktoz vb) incelenebileceği bildirilmiştir.

• SPEKTROFOTOMETRELER

• Absorbe edilen veya geçen ışın miktarını ölçmeye yarayan aletlere spektrofotometre veya kolorimetre denilir.

• SPEKTROFOTOMETRENİN BÖLÜMLERİ

• Modern bir fotometre ve spektrofotometre 5 ana bölümden oluşmaktadır. Bunlar: • 1. Işın kaynağı • 2. Monokromatör • 3. Küvet • 4. Fototüpler • 5. Fotometre veya Yazıcı

1. Işın Kaynağı • Genel olarak spektrofotometrelerde görünür alan (GA) ışınlarını üretmek için tungsten, UV bölge ışınlarını üretmek için ise Deuterium lambalar kullanılır. • Yine, bazı durumlarda H lambaları da yaygın olarak kullanılabilmektedir.

2. Monokromatör • spektrofotometrelerde istenilen dalga boyundaki ışınlar, beyaz ışın demetinden bir monokromatör (kolorimetrelerde bir filtre) yardımı ile seçilir.

3. Küvet • Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu, cam veya kuvartz gibi ışın geçirgen özelliğe sahip maddelerden yapılmış, özel kaplara küvet denir.

• Kullanılan küvetlerde kalınlık, genişlik amaca uygun olarak seçilir.

4. Fototüpler • Tanım olarak fototüp, gelen ışınların miktarını belirlemeye yarayan aletlerdir. Ayrıca, bunlara foton detektörleri de denilir.

5. Fotometre veya Yazıcı • Spektrofotometrelerdeki son kısım, sonuç okuma veya yazıcı bölümdür. • Bunlar, detektörden alınan sinyalin, analizcinin anlayabileceği bir forma dönüştürülmesini sağlayan • dijital bir gösterge veya • bir skala üzerindeki ibre hareketi, • bir kompütür sistemi, • ya da bir yazıcıda çizilen grafiktir.

• SPEKTROFOTOMETRE ÇEŞİTLERİ

• Bugün çeşitli ticari firmalar tarafından 200 -2500 nm dalga boyları arasında ölçümler yapabilen spektrofotometreler geliştirilmiştir. • bu aletler, UV, Görünür alan ve Infarared bölgelerinde bile ölçüm yapabilmektedir. • Ayrıca bunlar, bilgisayar sistemleri ile donatıldıkları için absorbans değeri ile kantitatif hesaplamalar alet tarafından yapılmaktadır. Diğer bir ifade ile standart ölçümlerinden sonra alet, kalibrasyon eğrisini kendisi hazırlayıp, direkt olarak konsantrasyonu verebilmektedir.

Genel olarak, dizayn şekline göre günümüzde yaygın bir şekilde kullanılan üç çeşit spektrofotometre bulunmaktadır. Bunlar; 1. Tek Işınlı Spektrofotometreler 2. Çift Işınlı Spektrofotometreler 3. Çift Işınlı ve Çift Kanallı Spektrofotometreler

• SPEKTROFOTOMETRELERİN ÇALIŞMA STABİLİTESİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER

• 1) Ani sıcaklık değişmeleri, • 2)Laboratuvar kontaminantlan (asit, asit buharı, organik çözücüler, vb), • 3) Çalışma sırasındaki elektrik-voltaj değişiklikleri, • 4) Temizlik şartları.

• 1. Standart madde tartım ve dilüsyon hataları, • 2. Çalışma şartlanndaki genel hatalar (kontaminantlar, bekletme süresi, oksidasyon, parçalanma, vb reaksiyonlar), • Çalışma sırasında kullanılan küvetten kaynaklanan hatalar; • Kalınlık, • Genişlik, • Malzeme çeşidi (cam, kuvartz, silika, plastik vb), • Temizlik (küvetin iç ve dış kısımlarındaki bulaşıklar vb).

• 3. Spektrofotometrenin kendi aksamından kaynaklanan hatalar; • Işın kaynağı, • Fototüp, • Yazıcı ve aletteki diğer ayarlama veya standardizasyon hataları.

• UV/VIS SPEKTROSKOPİSİNİN KULLANIM ALANLARI

• Görünür alan (VIS) ve ultraviyole (UV) spektrofotometreleri, gıda ve kimya laboratuvarlarında çok çeşitli kalitatif, kantitatif ve yapısal analizlerin yapılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır.

• 1. YAPISAL ANALİZLER

• 1. Difference spektroskopisi kullanılarak proteinlerin α -heliks sarmal yapıları, Hidrojen bağları ile bunların ayrışma özellikleri ve ihtiva ettikleri renkli yapı taşları hakkında bilgi edinilebilmektedir.

• 2. Protein ve DNA, RNA gibi makro moleküllerin yapısal modelleri ve bu bileşiklerin kullanılan solventlerle gösterdikleri bazı yapısal özellik veya değişiklikler hakkında çeşitli bilgiler elde edilebilmektedir.

• 3. UV/VIS tip spektrofotometreler kullanılarak bir kısım organik molekül veya bileşiklerin farklı p. H, tuz, sıcaklık ve solvent çeşidi veya özelliklerine göre verdiği absorbans değerlendirilerek ortaya çıkan yapısal değişmeler veya bunların tanımlanması yapılabilmektedir.

• Diğer bir anlatımla, sıcaklık, p. H, tuz konsantrasyonu ve solvent çeşidi gibi alternatifler değiştirilerek bazı parametreler belirlenir ve bir test materyali ile kıyaslanarak çalışılan bileşiğin bir kısım özellikleri tespit edilebilir.

• 2. KALİTATİF ANALİZLER

• UV-GA tipi spektrofotometrelerle kalitatif analiz imkanı hem oldukça sınırlıdır ve hem de çok sıhhatli bir şekilde yapılamamaktadır. Ancak burada analiz edilecek maddelerin direkt olarak tabii renginin verdiği absorpsiyon veya çeşitli bileşiklerle renklendirildikten sonraki absorpsiyonlan kolorimetrik anlamda değerlendirilmektedir.

• Ancak, burada kolorimetrik yöntemlerin yanında diğer bir kısım analitik metotların da birlikte kullanılması gerekebilir.

Karbonhidrat analizleri (Mono, di ve polisakkaritler, indirgen şekerler, oksi ve deoksi şekerler, gibi), • Amino asit, peptit ve protein analizleri, • Nükleik asit ve nükleotid analizleri, • Lipit ve steroid analizleri, • Vitaminler, • İnorganik elementler (P, Ca, Fe, vb), • ADP, ATP gibi azotlu bileşikler, • Toksin ve benzeri analizler

• 3. KANTİTATİF ANALİZLER

• • Kimya ve gıda laboratuvarlarmda yapılan kantitatif analizlerde, absorpsiyon spektroskopisi, vazgeçilmez öneme sahip tekniklerden birisidir. Lambert-Beer kanununun geçerli olduğu tüm ortamlarda bu tip spektrofotometrelerle kantitatif analizler yapılabilmektedir.

• Ayrıca, enzimatik reaksiyonlarla oluşan son ürün miktarının belirlenmesinde ve bazı kromatografi tekniklerinde de bu sistemler, detektör olarak kullanılabilmektedir. Yaygın olarak yapılan kantitatif analizler şunlardır :

1. Karbonhidrat Analizleri • UV/VIS spektrofotometreler kullanılarak bir çok yöntemle karbonhidrat analizi yapılabilmektedir. Örneğin, genel olarak karbonhidrat tayinlerinde yaygın olarak kullanılan yöntemlerden birisi fenol-sülfürik asit metodudur.

2. Aminoasit Analizleri • Genel olarak aminoasitlerin kantitatif olarak tayinlerinde uygulanan yöntemlerden birisi, ninhidrin metodudur.

3. Protein Analizleri • • • Spektrofotometre ile protein analizleri çok değişik yöntemlerle yapılabilir. Bunlar; a) UV absorbans metodu: b) Biüret metodu: c) Lowrv metodu: d) Bradford metodu: . e) Proteinlerde S-H ve S-S şuruplarının ölçümü: .

4) Nükleik Asit ve Nükleotit Analizleri • Çeşitli biyokimyasal analizlere ilaveten, özellikle balıklarda bayatlama sonucunda meydana gelen nükleik asitlerin ve bunların parçalanma ürünleri ile protein tayini sırasında belirlenen diğer azotlu bileşiklerin tespiti spektrofotometrik yöntemle yapılabilmektedir.

5) Lipit ve Steroid Analizleri • Burada yapılan en önemli analiz, kolesterol tayinidir.

6. Diğer Analizler • Gıda ve kimya laboratuvarlarında sıkça analiz edilen vitamin, ve mineraller ile bakteriyel ve mikotik toksinler, ATP gibi organik bileşikler de spektrofotometrik olarak tayin edilebilmektedir.

• 5. MİKROBİYOLOJİK ANALİZLER

• Yapılan araştırmalar, mikroorganizma hücre süspansiyonlarının oluşturduğu türbiditenin, ışınların bazı dalga boylarında absorbans verdiğini ortaya koymuştur. • İşte bu özellikten yararlanılarak mikroorganizma sayımları, çok hızlı bir şekilde yapılabilmektedir. .

• Bu şekilde yapılacak sayımlarda, çalışılan her mikroorganizma için ayrı standart kurve hazırlanması gerekmektedir. • Ayrıca, bu metodun kolay, hızlı ve örneği tahrip etmemesi gibi avantajlarına karşılık, hassasiyetinin nispeten düşük olduğu bilinmelidir.

• UV/VIS SPEKTROSKOPİ TEKNİĞİNİN ÜSTÜNLÜKLERİ

• 1. Geniş bir kullanım alanına sahip olması: Çok çeşitli organik ve inorganik bileşik, ışığı absorplama özelliğine sahiptir. Dolayısıyla bu bize, analitik bileşen ya da maddelerin; yapısal, kalitatif ve kantitatif analizlerine imkan vermektedir.

• 2. Yüksek derecede hassasiyet • 3. Doğruluk derecesinin yüksek oluşu • 4. Kullanım kolaylığı

• 5. Seçicilik kapasitesi: İyi bir dalga boyu seçimi ile gıda maddeleri gibi içerisinde her türlü bileşiğin bulunduğu bir ortamda bile istenilen bir maddenin tayini kolaylıkla yapılabilmektedir.