Metody identifikace DNA RFLP PCR a RAPD Molekulrn

Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD

Molekulární biologie § * 50. léta 20. století § popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick) § stavba a vztah biomolekul k funkcím a vlastnostem organizmů

Genetické markery § genetické markery = značky, ukazatele se silnou genetickou kontrolou, neovlivněnou prostředím • morfologické markery (barva květu) • biochemické markery (přítomnost určitých látek v rostlině podmiňují geny -> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu) • molekulární markery (analýzy DNA ) § DNA markery

Molekulární markery § umožňují identifikaci organizmu § stanoví příbuzenské vztahy § Výhoda DNA markerů: rychlá a spolehlivá determinace

RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism (polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů) u základní princip metody I. štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz II. elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky III. přenos fragmentů na membránu IV. hybridizace DNA

Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz u restrikční endonukleázy - enzymy izolované z bakterií – jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován (např. : Eco. RI - Escherischia coli, Alu. I - Arthrobacter luteus) – rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí – tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu – sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp Eco. RI - Alu. I -

Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky u u u elektroforéza obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly , resp. fragmenty DNA, podle jejich délky princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek

Přenos fragmentů na membránu u fragmenty DNA je nutné před přenosem (nebo během přenosu) na membránu denaturovat denaturací se rozumí rozpletení dvouřetězce DNA ve dva jednořetězce DNA na gel je přiložena nylonová membrána na níž je specifickým způsobem otisknuta DNA

Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda) u u u renaturace - proces vzniku dvouřetězcové DNA z jednořetězcových vláken hybridizace – renaturace s dvojím původem jednořetězcové DNA membrána s navázanou DNA se ponoří do roztoku jednořetězcové DNA, která je radioaktivně značena, tzv. sonda je krátká (150 - 8000 bází) a homologická (alespoň z větší části), aby k hybridizaci vůbec došlo sonda se navazuje jen na místa s komplementárním řetězcem po umytí a usušení je membrána přiložena na rentgenový film a ponechá se exponovat, film zčerná v místech, kde je navázána sonda

Pattern u elektroforetický profil (pattern)

Interpretace RFLP u porovnávání restrikčních fragmentů vzniklých štěpením odpovídajících úseků DNA • pattern • restrikční mapa - náročná záležitost u studium na úrovni rodů, druhů částečně poddruhů, nevhodnost při studiu mezi blízce příbuznými populacemi, nebo dokonce v rámci populace

Zhodnocení metody RFLP KLADY • vysoká reprodukovatelnost pattern • vysoká interpretovatelnost ZÁPORY • náklady • bezpečnost práce (radioaktivní materiál) • velké množství DNA • množství sondy • vysoce kvalifikovaný personál

PCR Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) - vyvinuto v 80. letech 20. století - jedna z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky základní princip metody • • • in vitro synéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklech fragmenty nasyntetizované během reakce lze pozorovat na agarózovém gelu možno analyzovat i velmi malé množství DNA

PCR - teplotní fáze 1. teplotní fáze 95 °C - denaturace zvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí) 2. teplotní fáze 35 - 65 °C – annealing ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA 3. teplotní fáze 72 °C – polymerace upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´ 3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

Průběh PCR daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2 n = počet fragmentů po n cyklech) Ø v praxi se používá cca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních složek a růst se zastavuje Ø poznámka: billion je v češtině miliarda

Zhodnocení metody PCR KLADY • • levnější a technologicky snazší oproti RFLP malé množství zpracovávané DNA ZÁPORY • vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se fatálně projeví) • nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů)

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA ► ► ► jedná se o modifikaci PCR Nevyžaduje znalost cílové sekvence DNA Významná pro systematickou a populační biologii

Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR R v názvu, zkracuje random, znamenající náhodný, protože výběr úseku, který bude pomnožen je ponechán náhodě ► v reakční směsi je přítomen pouze jeden primer o délce deseti nukleotidů ► reakční podmínky jsou odlišné (teplota 2. teplotní fáze je nižší (ca 34 °C), počet cyklů je vyšší (40 - 45 cyklů)) ►

Zhodnocení metody RAPD KLADY • • • použitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genom technologicky jednoduchá a rychlá metoda výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické zpracování) ZÁPORY • nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace) • lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití především v populační biologii)

Molekulární markery v lesnictví n n Identifikace cizorodého organismu (parazita, mykorrhizy apod. ) Příbuzenské vztahy a původ Deklarace vlastností sadebního materiálu Markery spojené s biotickými nebo abiotickými stresy

Nejvýznamnější zdroje informací n n www. ueb. cas. cz/download/manual. rtf http: //www. silvarium. cz/lesprace/03/01/clanek 12_vyzkum. html http: //botany. natur. cuni. cz/fer/markers/Markery 3 -DNA, PCR, RAPD. pdf http: //botany. natur. cuni. cz/fer/markers/Markery 5 -RFLP, cp. DNA. pdf

Děkujeme za pozornost.