Metody detekcji i identyfikacji bakterii Dorota abicka Zakad

Metody detekcji i identyfikacji bakterii Dorota Żabicka Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków Warszawa

Budowa komórki bakteryjnej

Badanie mikrobiologiczne l Cel: identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki l Tok badania mikrobiologicznego l l Pobranie materiału Badanie materiału: l l Metody klasyczne l Badanie mikroskopowe l Hodowla i identyfikacja drobnoustroju l Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki l Metody immunologiczne Metody molekularne

Pobieranie i przesyłanie materiału Rodzaj podłoża transportowego i rodzaj pojemników są dostosowywane do rodzaju materiału i kierunku badania (bakterie, wirusy, obecność przeciwciał)

Badanie mikroskopowe Mikroskop świetlny l Preparaty barwione l metoda Grama l metody specjalne np. barwienie na obecność zarodników l Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na końcu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza

Ściana komórkowa bakterii Bakterie Gram-dodatnie Bakterie Gram-ujemne

Badanie mikroskopowe Neisseria meningitidis Preparat z osadu płynu mózgowordzeniowego barwiony metodą Grama Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego

Badanie mikroskopowe Preparat z ciemnym polem widzenia (Treponema pallidum) l Mikroskop fluorescencyjny l

Badanie mikroskopowe Mikroskop kontrastowo-fazowy grzyby z rodzaju Candida

Badanie mikroskopowe Mikroskop elektronowy

Hodowla bakterii l Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i stałe l Hodowla prowadzona w warunkach najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych drobnoustrojów l Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium tuberculosis)

Wymagania wzrostowe bakterii l Zapotrzebowanie na tlen l l Źródło węgla l l l Tlenowe – O 2 Beztlenowe – mniej niż 1 -0, 5% O 2 Mikroaerofilne – mieszanina 5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2 Autotroficzne – CO 2 Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry, lipidy Pozostałe związki niezbędne do wzrostu l l Sole nieorganiczne Witaminy

Czynniki fizykochemiczne l Temperatura l l p. H l l Psychrofile – optimum 0 -10 C Mezofile – optimum 20 -40 C Termofile – optimum 50 -60 C Większość bakterii preferuje neutralne wartości p. H ~ 7. 0 Ciśnienie osmotyczne l Wiekszość preferuje aw ~ 0, 99

Wzrost hodowli bakterii w podłożu płynnym

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Podłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa hemolizy dookoła kolonii

Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojów CPS Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne Mac. Conkey agar

Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki – podłoża chromogenne MRSA ESBL VRE

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów wykonywanych na płytkach wrażliwość na bacytracynę test CAMP

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem zestawów probówkowych gotowych testów identyfikacyjnych

Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów VITEK 2 Compact Bio. Merieux Phoenix BD Diagnostic Systems

System VITEK 2 Compact System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych

Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojów l Oznaczanie metodą rozcieńczeniową l Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego l Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych

Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów oporności na antybiotyki Dyfuzja z krążka Podłoże z antybiotykiem Dyfuzja z paska Szczep gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) oporny na wszystkie antybiotyki -laktamowe (MRSA)

Metody immunologiczne Testy lateksowe, ELISA, immunofluorescencyjne wykrywające całe komórki lub antygeny bakterii (białka powierzchniowe, wielocukry otoczkowe, toksyny) l Pozwalają wykryć bakterie w materiale pobranym od chorego lub pomagają w identyfikacji wyhodowanych bakterii l Stosowane gotowe testy manualne lub automatyczne l Aglutynacja lateksowa

Metody immunologiczne - EIA

Metody immunologiczne – systemy automatyczne System VIDAS

Nowe metody oparte o metody immunologiczne

Spektrometria MALDI-TOF

Metody molekularne Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub real-time PCR l Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch wariantach l Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR l Zestawy odczynników lub zamknięte systemy diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy l Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M. tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych l

Genom bakteryjny Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów)

Metoda PCR

DNA Ruler 100 6018/99 6758/99 ATCC 43300 ATCC 29213 Ruler 100 Metoda PCR mec. A ok. 550 kb mec. A gen występujący u MRSA

Real-time PCR Krzywe reakcji real-time PCR

Szybkie testy molekularne np. Gene. Xpert

Sondy typu Scorpion Dwa rodzaje sond typu Scorpion stosowane w testach z serii Gene. Xpert rysunki: źródło Cepheid

Zintegrowana kontrola wewnętrzna w mieszaninie reakcyjnej Mg 2+ target scorpion Taq DNA Polymerase IC scorpion d. CTP d. GTP d. UTP Internal Control (IC) d. ATP rysunki źródło Cepheid