Metody bada toksycznoci substancji chemicznych Ustalanie ADI badania

Metody badań toksyczności substancji chemicznych Ustalanie ADI, badania epidemiologiczne

Toksykologia żywności Przedmiotem badań i oceny toksykologicznej są: n substancje naturalnie występujące w żywności n substancje stanowiące zanieczyszczenia żywności n substancje lub ich mieszaniny dodawane do żywności w określonym celu (dodatki do żywności)

Badania toksykologiczne n Dotyczą zazwyczaj działania określonego związku, rzadziej mieszaniny substancji znanych i bardzo rzadko mieszaniny o nieznanym składzie n Badania wykonuje się na kilku gatunkach zwierząt

Zwierzęta doświadczalne Są to najczęściej: n Myszy białe n Szczury białe n Chomiki n Świnki morskie n Króliki n Psy Do oceny działania mutagennego n Używa się bakterii i drożdży

Badania toksykologiczneznaczenie paszy n Dieta syntetyczna o stałym składzie n Dieta półsyntetyczna – składająca się tylko częściowo z czystych związków chemicznych (węglowodany, aminokwasy, witaminy, składniki mineralne) oraz z oczyszczonych składników naturalnych (skrobia, cukier, kazeina)

Podawanie paszy i wody n Najczęściej stosuje się podawanie paszy i wody ad libitum z jednoczesną kontrolą spożycia n Substancje badane podaje się w paszy, zgłębnikiem dożołądkowo (rzadko) lub w wodzie do picia n Przy badaniu wpływu metali na organizm woda powinna być dejonizowana

Badaniom powinny podlegać n Związki pochodzenia naturalnego lub ich mieszaniny n Związki otrzymane na drodze syntezy chemicznej lub ich mieszaniny n Związki lub ich mieszaniny otrzymane na drodze syntezy biologicznej, np. preparaty enzymatyczne n Nowe środki spożywcze lub preparaty, np. białkowe, tłuszczowe, ich substytuty dodawane do żywności

Zakres badań toksykologicznych n Toksyczność ostra, podostra i przewlekła n Działanie rakotwórcze n Działanie mutagenne n Działanie teratogenne i embriotoksyczne n Wpływ na płodność i rozrodczość n Metabolizm n Synergizm i antagonizm n Działanie drażniące oka i skóry n Działanie alergiczne

Zasady badań toksykologicznych n Do doświadczeń używa się zwierząt zdrowych, znanego szczepu i ze znanej hodowli; są to zwierzęta obu płci, młode, karmione bez ograniczeń paszą pełnowartościową zapewniającą prawidłowy wzrost i rozmnażanie

Toksyczność ostra n To działanie toksyczne wywołane podaniem badanej substancji w dawce pojedynczej lub w kilku dawkach w ciągu 24 h n Jej jednostką jest medialna DL 50 wyrażona w mg/kg m. c. zwierzęcia

Toksyczność ostra n Jej badanie przeprowadza się przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt, młodych, o zbliżonej masie ciała np. szczury ok. 200 g n Substancję podaje się per os w kilku różnych dawkach, obserwuje się zwierzęta przez określony czas (co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta, które padły w każdej grupie

Toksyczność ostra n Obserwacje powinny obejmować: początek wystąpienia, charakter i czas trwania objawów toksycznych n Powinny dotyczyć: ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, oddechowego, sercowo-naczyniowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, wyglądu skóry, błon śluzowych i oczu

Toksyczność ostra n Kilka dni przed podaniem badanej substancji i do czasu zakończenia obserwacji kontroluje się masę ciała początkową i końcową oraz spożycie paszy n Wykonuje się sekcję zwierząt padłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia oraz badania makro- i mikroskopowe narządów

Toksyczność podprzewlekła n Jej badanie wykonuje się na 2 gatunkach zwierząt (1 to najczęściej szczury, a drugi nie powinien być gryzoniem) n Czas trwania doświadczenia wynosi zwykle ok. 1/10 normalnego okresu życia zwierząt (szczury, myszy – 90 dni, świnie – 1 rok) n Używa się młodych zwierząt (np. szczury 4 -5 tyg. o masie ok. 50 -60 g)

Toksyczność podprzewlekła n Badaną substancję podaje się w paszy w 3 -4 różnych dawkach n Dawki powinny być tak dobrane aby jedna stanowiła poziom NOAEL a druga LOAEL n Wielkość dawek ustala się w badaniach pilotażowych trwających ok. 4 tyg.

Toksyczność podprzewlekła Zakres badań obejmuje Badania ogólne: n wygląd i ogólny stan zdrowia, zachowanie zwierząt n śmiertelność (ustalenie przyczyn) n codzienne spożycie paszy i wody n przyrost masy ciała

Toksyczność podprzewlekła Badania hematologiczne: n hematokryt n zawartość hemoglobiny n liczba krwinek czerwonych, białych i płytek krwi n czas protrombinowy

Toksyczność podprzewlekła Badania biochemiczne: n W surowicy: m. in. białko, glukozę, azot mocznikowy, TG, cholesterol, elektrolity, enzymy- ALAT, ASPAT, AP n W wątrobie: białko, enzymy- ALAT, ASPAT, AP i wiele innych Badanie moczu oraz badania hematologiczne i biochemiczne wykonuje się po 2, 4 i 12 tyg. równolegle w grupach badanych i kontrolnych

Toksyczność podprzewlekła n Badanie oczu – na początku i na końcu n Sekcja zwierząt padłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia – należy zważyć wszystkie narządy i wykonać n Badanie histopatologiczne – co najmniej 20 -22 narządów i tkanek

Toksyczność przewlekła n Dobór zwierząt jak w toksyczności podostrej n Czas trwania doświadczenia – praktycznie cały okres życia zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2 lata, myszy – 1, 5 roku, świń – 5 -7 lat

Toksyczność przewlekła n Substancję badaną podaje się w paszy w różnych dawkach ustalonych wcześniej w badaniach toksyczności podprzewlekłej, tak aby można było wyznaczyć poziomy: n NOAEL i LOAEL

Toksyczność przewlekła n Obserwacje zwierząt, badania krwi, wątroby i moczu – tak jak w badaniu toksyczności podostrej n po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla gryzoni) n Badania histopatologiczne – w zależności od wyników badań toksyczności podostrej mogą być poszerzone o inne narządy (aortę, oko, język, grasicę, ślinianki i inne)

Badanie rakotwórczości n Zwierzęta: myszy i szczury młode, jak w teście podprzewlekłym, pochodzące od rodziców otrzymujących przez ok. 2 miesiące przed kojarzeniem paszę z dodatkiem badanej substancji w odpowiednich dawkach

Badanie rakotwórczości Grupy zwierząt: n Kontrolna n Otrzymująca dawkę maksymalną – n Otrzymująca 1/3 dawki maksymalnej n Otrzymująca 1/9 dawki maksymalnej

Badanie rakotwórczości Liczba zwierząt n 100 szczurów (po 50 każdej płci) dla każdego poziomu dawki n 100 myszy (po 50 każdej płci) dla każdego poziomu dawki Czas podawania substancji w paszy n Szczury – 2 lata n Myszy – 1, 5 roku n Psy, świnie – 5 -7 lat

Badanie rakotwórczości Obserwacje: n Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak w toksyczności przewlekłej n Stan zwierząt – każdego dnia, dzień śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę na podstawie sekcji n Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt i badania makroskopowe, waży się: wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza, węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg, przysadkę, jądra, płuca, pęcherz

Badanie rakotwórczości n Wykonuje się rozmaz krwi i szpiku n Badana mikroskopowe 7 pierwszych narządów ale bada się także te narządy, w których obserwowano zmiany w czasie sekcji

Badanie rakotwórczości Interpretacja: n Oparta jest na liczbie się guzów i czasie ich pojawienia się w tych samych narządach zwierząt badanych i kontrolnych oraz czasie przeżycia zwierząt n Uwzględnia się guzy złośliwe i niezłośliwe

Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na potomstwo n Ma na celu zbadanie możliwego wpływu badanej substancji na płodność i laktację oraz pozwala na zaobserwowanie zmian genetycznych n Grupy zwierząt i dawki – jak przy toksyczności przewlekłej

Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na potomstwo Obserwacje: n % zapłodnienia n Okres ciąży (krótszy, dłuższy) n Liczba młodych w każdym miocie n Masa ciała młodych n Śmiertelność noworodków n Odchylenia od stanu prawidłowego w 4, 12 i 21 dniu życia n Badania histopatologiczne narządów od 10 samic i 10 samców z każdej grupy

Badanie teratogenności Zwierzęta: n Szczury, chomiki, króliki (zalecane samice po raz pierwszy zapładniane), po 20 zwierząt dla każdej dawki n Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i płciowo n Badaną substancję podaje się w paszy ciężarnym samicom w okresie organogenezy (szczury – 6 -15 dzień ciąży, chomiki – 6 -10 dzień, króliki dzień- 6 -18)

Badanie teratogenności n Dawkowanie substancji zależy od szybkości jej wydalania z organizmu oraz jej działania embrio- i cytotoksycznego

Badanie teratogenności Wymagane są co najmniej 3 poziomy dawek, np. n Grupa kontrolna n Grupa otrzymująca dawkę małą – 1/250 DL 50 n Grupa otrzymująca dawkę pośrednią – 1/100 DL 50 n Grupa otrzymująca dawkę dużą – 1/50 DL 50

Badanie teratogenności Obserwacje: n Spożycie paszy i wody oraz kontrola masy ciała w określonych dla danego zwierzęcia dniach ciąży n Płody wyjmuje się przez cesarskie cięcie u szczurów na 1 dzień przed porodem, u królików – 2 dni

Badanie teratogenności Ocenia się: n Liczbę płodów po prawej i lewej stronie macicy n Liczbę resorpcji n Liczbę ciałek żółtych n Masę płodów z łożyskiem i bez n Długość płodu z ogonem, długość ogona n Płeć n Deformacje makroskopowe n Deformacje szkieletu n Liczbę krwiaków

Badanie teratogenności n. U 20% samic w grupie nie wykonuje się cesarskiego cięcia n Płody normalnie urodzone obserwuje się przez 2 -3 miesiące aby wychwycić wady pojawiające się w czasie rozwoju n Wybrane losowo zwierzęta kojarzy się w celu otrzymania II generacji n Młode tej generacji usypia się po 21 dniach i bada ich rozwój

Badanie mutagenności n Działanie mutagenne jest ściśle związane z działaniem rakotwórczym n Ok. 90% związków rakotwórczych wykazuje działanie mutagenne w prostych testach bakteryjnych

Badanie mutagenności n Stosuje się testy bakteryjne Amesa n Pozwalają wykryć mutacje punktowe: Ø mikrojąderkowy – umożliwia wykrycie uszkodzeń w chromosomach Ø test reperacji DNA

Badanie działania alergicznego - kontaktowego n Testy na zwierzętach n Badania z udziałem ludzi – testy w klinikach dermatologicznych Dotyczą kosmetyków i środków piorących

Ekstrapolacja wyników badań n Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich badań na zwierzętach oraz ustaloną w badaniach toksyczności przewlekłej dawkę NOAEL – ustala się dawkę ADI dla człowieka ADI = NOAEL : 100 (najczęściej ale może to być także : 10 lub : 1000)

Badania epidemiologiczne Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie wnikające do organizmu ma potencjalne właściwości rakotwórcze jest możliwe: Retrospektywne badanie epidemiologiczne jeżeli wykaże ono zależność między ekspozycją na czynnik rakotwórczy i zachorowalnością oraz śmiertelnością – czynnik może zostać uznany za rakotwórczy dla ludzi