Metody bada molekularnych ELEKTROFOREZA ruch jonw i makromoleku

Metody badań molekularnych

ELEKTROFOREZA – ruch jonów i makromolekuł obdarzonych ładunkiem elektrycznym poprzez medium w wyniku przyłożonego napięcia Dla liniowej cząsteczki szybkość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do log z masy cząsteczkowej Czynniki wpływające na szybkość migracji w żelu: • • Wielkość cząsteczki Konformacja D|NA Koncentracja agarozy Wartość przyłożonego napięcia Skład nukleotydów i temperatura Obecność barwników interkalujących Skład i siła jonowa buforu do elektroforezy

RFLP – restriction fragment length polimorphism • Najwcześniejsza i główna metoda detekcji zmienności genetycznej na poziomie DNA • Metoda ta oparta jest na enzymach restrykcyjnych izolowanych z różnorodnych gatunków bakterii • Enzymy te rozpoznają specyficzną sekwencje, zwykle 4 -6 par zasad i rozcinają symetrycznie obydwie nici DNA na zdefiniowane i powtarzalne fragmenty

Co daje nam trawienie restrykcyjne? • Fragmenty DNA na żelu w postaci prążków o identycznej sekwencji • Precyzyjna obróbka DNA, powtarzalność fragmentacji cząsteczki • Jest podstawą do mapowania genetycznego • Identyfikacja mutacji, diagnostyka • Rekombinowanie i klonowanie genów

RFLP – Protokół • Izolacja jądrowego (mt) DNA • Trawienie enzymem restrykcyjnym w optymalnych warunkach dla działania restryktazy • Rozdział fragmentów w procesie elektroforezy na żelu agarozowym • Southern blotting – detekcja specyficznych prążków

Southern blotting • Metoda oparta na hybrydyzacji kwasów nukleinowych • metoda czasochłonna, stosunkowo droga ale bardzo specyficzna • Na pełną analizę składa się 5 etapów: 1) Trawienie restrykcyjne – enzym dodawany jest do próbki DNA 2) Elektroforeza – mieszanina fragmentów restrykcyjnych rozdzielana jest w procesie elektroforezy. DNA z każdej próbki tworzy charakterystyczny układ prążków 3) Blotting – przeniesienie pasma cząsteczek DNA na nitrocelulozowy lub nylonowy filtr przy wykorzystaniu sił kapilarnych 4) Hybrydyzacja z radioaktywną sondą – inkubacja filtra w roztworze zawierającym znakowana sondę DNA w celu wykrycia tych fragmentów, które zawierają sekwencje komplementarne do sondy 5) Autoradiografia – ekspozycja kliszy rentgenowskiej na promieniowanie izotopów zawartych w sondzie zlokalizowanej na filtrze.

Autoradiogram analizy Southern-blotting

DOT-BLOT • technika ta wykorzystywana jest do bezpośredniej detekcji mutacji • próbki DNA nanoszone są na membranę w dwóch powtórzeniach i hybrydyzowane z sondą wyznakowana radioaktywnie dla allelu dzikiego oraz zmutowanego • po hybrydyzacji naświetla się film rentgenowski wykorzystując iluminację pochodzącą z membrany • technika prosta, relatywnie szybka ale czasem daje zbyt duże tło

Aparatura do dot- blot’u

PCR – łańcuchowa reakcja polimeryzacji • technika ta umożliwiła rozwój technik molekularnych oraz możliwość różnorodnej manipulacji na poziomie DNA • umożliwia uzyskanie niezwykle dużej liczby kopii danej sekwencji DNA w krótkim czasie • teoretycznie dla PCR wystarczy tylko jedna cząsteczka docelowa

Składniki potrzebne do reakcji PCR: • Bufor – utrzymuje mieszaninę reakcyjną w p. H potrzebnym do zajścia reakcji • jony Mg++ – niezbędne do właściwego działania Polimerazy • Deoxynukleotydy (d. NTP) – substraty dla DNA Polimerazy (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP) – niezbędne do budowania nowego łańcucha DNA • Startery – specyficzne oligonukleotydy komplementarne do fragmentów flankujących region DNA który chcemy amplifikować • Taq DNA Polimeraza – termostabilny enzym dobudowujący nowe deoxynukleotydy do matrycy • Matryca DNA - DNA które ma być amplifikowane podczas reakcji • Woda NAJCZĘŚCIEJ TO SEKWENCJA I STĘŻENIE STARTERÓW DECYDUJE O POWODZENIU REAKCJI

PCR – reakcja cykliczna : Na reakcję PCR składają się 3 główne kroki, które powtarzane są 30 -40 razy. Reakcję przeprowadza się w automatycznym cyklerze, który potrafi bardzo szybko zmieniać temperaturę otoczenia próbki. 1) Denaturacja w 94°C : Podczas denaturacji przez podgrzewanie DNA zrywane są połączenia pomiędzy łańcuchami – w wyniku czego cząsteczka DNA rozdziela się na 2 nici

PCR – reakcja cykliczna : 2) Przyłączanie starterów w 40 OC-60 OC (Annealing): Mieszaninę chłodzi się do określonej temperatury, w której startery mogą utworzyć dwuniciowe struktury hybrydowe na końcu każdej nici DNA. Każdy ze starterów wiąże się tylko z jedną nicią wyjściowego DNA

PCR – reakcja cykliczna : 3) Elongacja w 72°C : W tej temperaturze zachodzi optymalna polimeryzacja z wykorzystaniem zawartych w mieszaninie reakcyjnej nukleotydów. Polimeraza DNA kopiuje każdą jednoniciową matrycę przez wydłużanie każdego ze starterów w kierunku od 3’ do 5’. Po elongacji gotowa jest kompletna nowa cząsteczka DNA składająca się w połowie z nowej a w połowie ze starej nici i proces może zacząć się od początku

Maszyna do PCR termocycler

zastosowanie PCR w analityce medycznej • do wykrywania specyficznych fragmentów DNA o określonej długości (np. multiplex PCR-STR) • do wykrywania zmian we fragmentach DNA (najczęściej w połączeniu z inną techniką)

PCR-RFLP • Amplifikacja ze specyficznymi primerami • Detekcja produktów przy użyciu elektroforezy poziomej na żelu agarozowym • Inkubacja z enzymem restrykcyjnym w specyficznych dla niego warunkach • Rozdział produktów trawienia w procesie elektroforezy poziomej na żelu agarozowym • Analiza wyników

Wynik analizy PCR-RFLP

wynik analizy PCR-RFLP dla VDR

Zalety PCR-RFLP • Bardzo dobra metoda bezpośredniej detekcji mutacji punktowych, zwłaszcza SNP • Metoda jest prosta, szybka i tańsza niż southern blotting • Rezultaty PCR-RFLP są bardzo łatwe do interpretacji

PCR allelospecyficzna • do diagnostyki określonej mutacji punktowej • przeprowadza się dwie niezależne reakcje PCR: z jednym starterem zstępującym i dwoma wstępującymi • primery wstępujące różnią się tylko jednym nukleotydem na końcu 3’ – który jest komplementarny do nukleotydu allelu prawidłowego lub patologicznego

SSCP – single-strand conformational polymorphism • technika używana do detekcji małych delecji, insercji i innych punktowych mutacji • pewne mutacje zaburzają drugorzędową strukturę ss. DNA przez co zmieniają również ruchliwość danego fragmentu w żelu • metoda ta pozwala rozróżnić podczas elektroforezy fragmenty o zmienionej sekwencji

Wynik analizy SSCP w rodzinie ze schorzeniem autosomalnym dominującym zmutowany allel dziki allel

Snap. Shot - protokół • wstępna amplifikacja • minisekwencjonowanie – reakcja z primerami zawierającymi wyznakowane nukleotydy • rozdział w denaturującym żelu poliakrylamidowym z użyciem aparatu ABI 377 w obecności standardu wewnętrznego LIZ 120.

Snap. Shot • umożliwia typowanie wielu markerów i polimorfizmów zlokalizowanych w jednym obszarze jednocześnie, co pozwala ograniczyć potrzebną ilość materiału wyjściowego oraz skrócić czas analizy • Metoda polega na amplifikacji matrycy (produktu PCR) z użyciem primerów zaprojektowanych tak aby identyfikowany polimorfizm był umiejscowiony dokładnie jedną parę zasad za końcem primera.

Do mieszaniny reakcyjnej dodajemy tylko wyznakowane fluorescencyjnie, zmodyfikowane mononukleotydy – terminatory reakcji amplifikacji, dzięki czemu podczas reakcji powstają produkty o długości o jedną parę zasad dłuższe niż primer, wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym. Fluorochrom po wzbudzeniu światłem lasera emituje energię o określonej długości fali, przekładającej się na barwę charakterystyczną dla danego znacznika a tym samym wyznakowanej nim zasady.

Sekwencjonowanie DNA • Metoda dideoksynukleotydowa (Sangera) opiera się na syntezie in vitro nici DNA komplementarnej do łańcucha sekwencjonowanego • Kiedy Polimeraza wstawia dideoksynukleotyd do syntetyzowanego łańcucha to uniemożliwia jego dalsze wydłużanie ponieważ dd. XTP nie posiada grupy –OH w pozycji 3’ dideoksyrybozy i niemożliwe jest utworzenie kolejnego wiązania fosfodiestrowego

Procedura Przygotowujemy 4 mieszaniny reakcyjne, z których każda zawiera: - matryce DNA – czysty produkt (najczęściej PCR), który ma być sekwencjonowany - Polimeraza DNA - jeden starter (ponieważ badana jest tylko jedna z nici) - mieszanina nukleotydów (d. ATP, d. CTP, d. GTP, d. TTP) - jeden z dideoksy analogów nukleotydów wyznakowanych izotopem (2’-3’-dideoksypochodne trifosforanów nukleozydów dd. NTP) Przeprowadza się 4 równoległe reakcje oznaczone „A”, „C”, „G”, „T”. W każdej jest jeden z didoksynukleotydów. Po skończonej reakcji próbki nakłada się na żel w sąsiadujących ścieżkach, gdzie migrują w polu elektrycznym proporcjonalnie do długości. Specjalne żele pozwalaja rozróżnić łańcuchy różniące się jednym nukleotydem.

GTTAGACCTGACATGCTGACTTGCATGCGGAATGACTG ACCTGAAATG

Radiogram sekwencjonowania DNA metodą Sangera Rozdzielone łańcuchy poddaje się autoradiografii Sekwencję odczytuje się z radiogramu litera po literze

Automatyczne sekwencjonowanie DNA – procedura Przygotowujemy 1 mieszaninę reakcyjną, która zawiera: - matryce DNA – czysty produkt (najczęściej PCR), który ma być sekwencjonowany - Polimeraza DNA - jeden starter (ponieważ badana jest tylko jedna z nici) - mieszanina nukleotydów (d. ATP, d. CTP, d. GTP, d. TTP) - mieszanina czterech dideoksynukleotydów wyznakowanych fluorochromem charakterystycznym dla danego d. NTP Automatyczne sekwencjonowanie oparte jest na metodzie Sangera, a jedyną różnicą jest to, że wszystkie wyznakowane fluorescencyjnie dd. NTP umieszczamy w jednej probówce.

Automatyczne sekwencjonowanie DNA Po reakcji w termocyklerze przeprowadzamy elektroforezę w denaturującym żelu poliakrylamidowym i rozdzielamy fragmenty według masy cząsteczkowej. Podczas tego procesu fluorochrom winkorporowany w dd. NTP wzbudzany światłem lasera emituje energię o określonej długości fali, która sczytywana jest przez specjalną kamerę współpracującą z komputerem