METABOLIZM PODSTAWOWY I D I O L I

METABOLIZM PODSTAWOWY I D I O L I T Y ŹRÓDŁO WĘGLA EMP HMP cykl Krebsa LIPIDY METABOLITY POŚREDNIE (pirogronian, PEP, acetylo-Co. A, sukcynylo-Co. A, fosforany, cukrów) POLISACHARYDY BIAŁKA I D I O L I T Y KWASY NUKLEINOWE METABOLIZM WTÓRNY

METABOLITY WTÓRNE (IDIOLITY) ILOŚCIOWO DNA 25% 29% 75% METABOLITY PODSTAWOWE 71% BIOMASA METABOLITY WTÓRNE 5% METABOLITY PODSTAWOWE METABOLITY WTÓRNE 95% METABOLITY PODSTAWOWE METABOLITY WTÓRNE • Nie pełnią podstawowych funkcji biologicznych • Powstają w metabolizmie ograniczonej liczby gatunków, a nawet szczepów • Ich biosynteza ściśle zależy od warunków hodowli • Są zazwyczaj syntetyzowane jako grupy podobnych struktur chemicznych

SKĄD SIĘ WZIĘŁY IDIOLITY ? Hipoteza uniwersalna Relikt procesu ewolucyjnego Wolna gra ewolucyjna

TEORIE WYJAŚNIAJĄCE POWSTANIE IDIOLITÓW Hipotezy o charakterze uniwersalnym, zakładają, że dla komórki istotne są same przemiany, a nie ich produkt końcowy. Metabolity wtórne mogą być jakościowym efektem zmian metabolizmu, które zachodzą po zakończeniu procesu wzrostu. Nowy typ przemian ma na celu zapewnienie komórce aktywności metabolicznej i stanu równowagi w warunkach, kiedy jej podstawowy metabolizm, wzrost i rozmnażanie jest już niemożliwe.

TEORIE WYJAŚNIAJĄCE POWSTANIE IDIOLITÓW Metabolity wtórne mogą być też reliktem procesu ewolucyjnego. We wczesnym etapie powstawania procesów życiowych, wiele niskocząsteczkowych związków mogło pełnić rolę np. kofaktorów lub regulatorów w biokatalizie. Z czasem utraciły jednak swoją pierwotną funkcję, a w wyniku zmian strukturalnych uzyskały nową aktywność biologiczną, która nie jest istotna dla prawidłowego wzrostu i rozwoju ich producentów.

TEORIE WYJAŚNIAJĄCE POWSTANIE IDIOLITÓW Według najnowszej hipotezy, metabolity specyficzne są efektem wolnej gry ewolucyjnej, która zachodzi przez cały okres rozwoju organizmów żywych. Toczy się ona na marginesie pięciu podstawowych poziomów procesów życiowych drobnoustrojów i nie podlega ścisłym regułom selekcji, przejawiającej się m. in. eliminowaniem metabolitów obojętnych, czy niekorzystnych dla komórki. Peryferyjność tego obszaru sprawia, że produkty aktualnie niepełniące funkcji biologicznej mogą być zachowane przez długi 5. MORFOGENEZA czas i ujawniać się jedynie w określonych warunkach rozwoju 4. RÓŻNICOWANIE drobnoustrojów. Mogą również w 3. TRANSPORT tym czasie ulegać różnym 2. REGULACJA modyfikacjom strukturalnym, a jeśli taki zmieniony produkt 1. 1. REAKCJE nabędzie nową, pożyteczną WO ELEMENTARNE LNA cechę – trafia wówczas na GR odpowiedni poziom (ME A EW TAB OLU podstawowych procesów, a geny CYJ OLI WT Z NA ÓR kodujące jego syntezę NY) M przetrwają w populacji.

JAK DZIAŁAJĄ IDIOLITY 2 1 3 5 4

ANTYBIOTYKI A TOKSYNY ANTYBIOTYKI TOKSYNY IDIOLITY

KLASY METABOLITÓW WTÓRNYCH POCHODNE AMINOKWASÓW POCHODNE CUKRÓW ZWIĄZKI MAKROCYKLICZNE CHINONY I ICH POCHODNE INNE

KLASY METABOLITÓW WTÓRNYCH antybiotyki ß-laktamowe (np. penicyliny, cefalosporyny), antybiotyki peptydowe (np. nizyna, bacytracyna, polimyksyny) aminoglikozydy (np. streptomycyna, gentamycyna, neomycyna), glikolipidy (np. moenomycyna) makrolidy właściwe (np. erytromycyna, oleandomycyna), makrolidy polienowe (np. amfoterycyna b, nystatyna), ansamycyny (np. ryfamycyna) tetracykliny (np. chlorotetracyklina, oksytetracyklina, tetracyklina), antracykliny (np. daunorubicyna, aklarubicyna), benzochinony (np. mitomycyna) pochodne cykloalkanów (np. cykloheksimid), nukleozydy (np. polioksyna), polietery (np. lasalocyd), związki aromatyczne (np. chloramfenikol, gryzeofulwina)

ZJAWISKO ANTYBIOZY I DEFINICJA ANTYBIOTYKÓW Antybioza (Vuillemin, 1889) swoisty antagonizm między organizmami żywymi polegający na wytwarzaniu przez jedne z nich produktów metabolizmu wywierający niekorzystny wpływ na inne Antybiotyki drobnocząsteczkowe substancje naturalne, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego oraz ich półsyntetyczne pochodne, a także syntetyczne analogi, które w małym stężeniu działają wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamując wzrost lub rozmnażanie komórek drobnoustrojów, wirusów i komórek nowotworowych

ZANIM ODKRYTO PENICYLINĘ…. v Już przed ponad 3000 tysiącami lat, Chińczycy stosowali spleśniałe produkty sojowe do oczyszczania ran skóry. Pleśnie używane były do leczenia infekcji również przez różne starożytne kultury (np. przez Greków i Egipcjan). v W pochodzących sprzed 1400 lat, kościach mieszkańców Nubii (płn-wsch Afryka), wykryto związki tetracyklinowe. v Jeszcze przed wprowadzeniem pojęcia antybiozy, L. Pasteur i J. F. Joubert (1877) rozważali możliwość stosowania mikroorganizmów w lecznictwie zauważając, że niektóre bakterie hamują rozwój laseczek wąglika. v Pod koniec XIX wieku ukazała się praca dotycząca piocyjanazy – wyciągu bakteriolitycznego z hodowli Pseudomonas aeruginosa, stosowanego do zwalczania wąglika. Była ona stosowana do leczenia zakażeń bakteryjnych w Niemczech w latach 1928 – 1935. v Pierwszym chemicznie zidentyfikowanym bioproduktem o działaniu antybiotycznym był kwas mykofenolowy uzyskany z hodowli grzyba Penicillium brevicompatum. W 1896 roku B. Gosio opisał jego antagonistyczne działanie wobec bakterii, grzybów i promieniowców.

HISTORIA PENICYLINY http: //www. youtube. com/watch? v=CIk. Utf. J 0 y. YQ&annotation_id=annotation_116621&feature=iv W dziedzinie odkryć naukowych szczęśliwy przypadek sprzyja umysłom przygotowanym (L. Pasteur)

INNE ANTYBIOTYKI, ICH PRODUCENCI I ODKRYWCY • gliotoksyna z Trichoderma viride (R. WEINDLING, 1932) • tyrocydyna i gramicydyna z Bacillus subtillis (R. J. DUBOS, 1939) • gryzeofulwina ze Streptomyces griseofulvus (A. E. OXFORD, 1939) • aktynomycyna ze Streptomyces antibioticus (S. A. WAKSMAN, 1940) • streptomycyna ze Streptomyces griseus (S. A. WAKSMAN, 1944) • bacytracyna z Bacillus subtilis (B. A. JOHNSON, 1945) • aureomycyna ze Streptomyces aureofaciens (R. DUGGAR, 1948)

DROBNOUSTROJE WYTWARZAJĄCE ANTYBIOTYKI PROMIENIOWCE > 10 000 antybiotyków Streptomyces > 6 000 Micromonospora > 400 Nocardia ~ 300 PROMIENIOWCE INNE BAKTERIE > 3 000 antybiotyków Bacillus ~ 200 Pseudomonas ~ 100 GRZYBY > 6 000 antybiotyków Penicillium ~ 200 Aspergillus ~ 100

SPEKTRUM DZIAŁANIA ANTYBIOTYKÓW Do najpowszechniej stosowanych w lecznictwie, należą antybiotyki o następującym zakresie (spektrum) działania: • antybiotyki przeciwbakteryjne Ø o szerokim spektrum działania na różne grupy bakterii np. cefalosporyny, tetracykliny, streptomycyna, gentamycyna Ø działające na bakterie Gram-dodatnie np. penicyliny, cykloseryna, bacytracyna, wankomycyna Ø działające na bakterie Gram-ujemne np. kolistyna, polimyksyna B • antybiotyki przeciwgrzybowe np. nystatyna, gryzeofulwina, fumigalina • antybiotyki przeciwnowotworowe np. aktynomycyna, bleomycyna, mitomycyna

Dane ze sprzedaży antybiotyków w Unii Europejskiej i Szwajcarii (1997 rok) Lecznictwo ludzi ~ 5 500 ton Weterynaria ~ 3 500 ton Zwierzęce promotory wzrostu ~1 500 ton Średnia dawka antybiotyków: ludzie – 241 mg/kg masy ciała zwierzęta – 54 mg/kg masy ciała

DEZAKTYWACJA ANTYBIOTYKU PRZEZ ZWIĄZANIE ZE STRUKTURAMI KOMÓRKOWYMI AKTYWNY TRANSPORT ANTYBIOTYKU POZA KOMÓRKĘ ZMIANA MIEJSCA DZIAŁANIA (uchwytu) ANTYBIOTYKU MECHANIZMY OPORNOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI BRAK MIEJSCA UCHWYTU ANTYBIOTYKU ZMIANA METABOLIZMU – wytworzenie alternatywnej drogi pozwalającej ominąć etap wrażliwy na antybiotyk BLOKADA TRANSPORTU ANTYBIOTYKU DO KOMÓRKI ZWIĘKSZENIE STĘŻENIA INAKTYWOWANEGO ENZYMU PRZEZ ANTYBIOTYK

RODZAJE OPORNOŚCI naturalna - związana jest z ewolucyjnym przystosowaniem bakterii do wielu naturalnych toksyn występujących w środowisku nabyta - związana jest z nabyciem genu zawierającego informację o oporności na daną toksynę na drodze mutacji lub od innego organizmu

GDZIE ZNAJDUJE SIĘ INFORMACJA O OPORNOŚCI CHROMOSOMY PLAZMIDY R TRANSPOZONY i inne elementy ruchome KASETY GENOWE I INTEGRONY

Cecha (np. oporność na antybiotyki) determinowana przez geny zlokalizowane na chromosomie zwykle jest bardziej stabilna, w porównaniu z cechą kodowaną przez elementy pozachromosomalne. . Są to plazmidy, które zawierają w swym genomie co najmniej jeden gen determinujących oporność na antybiotyki. Niektóre plazmidy R mogą nosić wieloraką oporność na kilka różnych antybiotyków. Są to liniowe fragmenty DNA (tzw. „skaczące geny”), posiadające charakterystyczne zakończenia nazywane sekwencjami insercyjnymi czyli IS - sekwencje nukleotydów zakończone odwróconymi powtórzeniami. Transpozony nie mogą się samodzielnie replikować. Aby informacja w nich zawarta nie zginęła podczas podziału komórki, muszą połączyć się z chromosomem lub plazmidem poprzez sekwencje insercyjne (IS). Geny oporności umiejscowione na transpozonach i integronach mogą zmieniać położenie i integrować się z chromosomem – tak powstają szczepy oporne na jeden lub kilka antybiotyków, cecha ta staje się bardziej stabilna. Kasety genowe warunkujące oporność na antybiotyki składają się z jednego genu oporności i sekwencji nukleotydowej zwykle złożonej z 59 par zasad (miejsce att. C) – odpowiedzialnej za rekombinację tego genu z cząsteczką zdolną do replikacji. Odbywa się to za pośrednictwem integronu – innej cząsteczki będącej ruchomym elementem pozachromosomowym. Pełni on funkcję receptora dla kaset genowych. Niektóre integrony wchodzą w skład transpozonów. Dzięki odpowiedniej budowie, mogą „chwytać” geny pochodzące z zewnątrz i zapewniają ich ekspresję.

NABYWANIE OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI MUTACJE KONIUGACJA TRANSDUKCJA TRANSFORMACJA TRANSPOZYCJA

Mutacje - zmiany w informacji genetycznej, zachodzące spontanicznie lub wywoływane różnymi czynnikami mutagennymi, np. fizycznymi (promieniowanie UV, promieniowaniem X), czy chemicznymi (azotyny, nitrozoaminy). Mutacje mogą dotyczyć pojedynczych lub sekwencji zasad w nukleotydach, a nawet całych genów. W ten sposób mikroorganizmy nabywają nową cechę, np. oporność na antybiotyki, która jest dziedziczona. Formy oporne, powstałe w wyniku mutacji spontanicznych uzyskuje się na stałym podłożu selektywnym zawierającym antybiotyk (rysunek). Takie warunki uniemożliwiają wzrost osobnikom wrażliwym, pozwalają natomiast na utworzenie kolonii jedynie bakteriom opornym. Pojawiają się one z częstością 1 na 10 9 – 10 12 komórek. pożywka bez antybiotyku pożywka z antybiotykiem niski przed selekcją po selekcji wysoki poziom oporności

KOMÓRKA DAWCY KOMÓRKA BIORCY Koniugacja (dotyczy tylko plazmidów koniugacyjnych) - polega na przeniesieniu plazmidu R lub fragmentu chromosomu zawierającego gen oporności z jednej komórki (dawcy) do drugiej (biorcy), czemu towarzyszy replikacja DNA. Kanał koniugacyjny W ten sposób komórka oporna skutecznie „zaraża” inne bakterie mogące należeć do innego gatunku, a nawet rodzaju. Chromosom bakteryjny Plazmid R Chromosom bakteryjny

Transdukcja Bakteriofag Chromosom bakterii (dawca) – informacja genetyczna przenoszona jest za pośrednictwem bakteriofaga. 1 1. Bakteriofag niosący własną informację genetyczną (kolor czerwony) infekuje komórkę bakteryjną 2. Kwasy nukleinowe, zarówno bakteryjne, jak i bakteriofagowe zostają pocięte na mniejsze części pod wpływem enzymów fagowych 2 3 4 5 Chromosom bakterii (biorca) 3. Bakteriofag, powiela przyniesioną informację genetyczną i opuszcza komórkę bakteryjną; niektóre kapsydy zostały przy okazji "załadowane" bakteryjnym DNA (kolor zielony) z genem oporności. 4. Bakteriofag niosący bakteryjny DNA infekuje kolejną bakterię 5. DNA z komórki bakterii - dawcy zostało wstrzyknięte do komórki bakterii - biorcy. Fragment DNA z komórki dawcy zostaje zastąpiony DNA biorcy. Komórka biorcy nabywa cechę oporności.

Transformacja – pobieranie przez komórki kompetentne materiału genetycznego uwalnianego do środowiska po śmierci komórki opornej. Egzogenny DNA jest wbudowywany w chromosom bakterii wrażliwej na drodze rekombinacji. Komórka oporna DNA z genem oporności DNA komórki wrażliwej Komórka zawierająca gen oporności

Transpozycja – przekazywanie genu oporności znajdującego się w transpozonach (Tn) lub kasetach genowych (za pośrednictwem mobilnych integronów). Jest to najważniejsze źródło powstawania coraz to nowszych szczepów opornych, a wśród nich bakterii pozbawionych wrażliwości równocześnie na kilka antybiotyków (tzw. oporność wieloraka). Wynika to z „ruchliwości” transpozonów oraz ich zdolności mutagennych powodowanych wbudowaniem się w różne miejsca chromosomu lub plazmidu. Mogą one także pokonywać bariery międzygatunkowe i międzyrodzajowe. Integrony nie mają zdolności samoprzenoszenia, ale mogą łączyć się z elementami IS, transpozonami oraz plazmidami koniugacyjnymi, które służą jako wektory do przenoszenia informacji genetycznej. Jeden integron może wbudować do swej struktury jedną lub kilka kaset i wraz z nimi zajmować trwałą pozycję w chromosomie lub plazmidzie.

Do czego przydać się mogą geny odporności Markery genetyczne ARM – antibiotic resistant markers 1. ODRÓŻNIENIE GATUNKÓW ROŚLIN ZMODYFIKOWANYCH GENETYCZNIE (GMO) OD NATURALNYCH 2. SPRAWDZENIE SKUTECZNOŚCI TRANSFERU POŻĄDANEGO GENU W ZMODYFIKOWANYCH LINIACH KOMÓRKOWYCH

PROBIOTYKI - preparaty lub produkty zawierające żywe, specyficzne szczepy mikroorganizmów, które podawane człowiekowi lub zwierzętom, wywierają na ich organizm korzystny wpływ Jako naturalne stymulatory wzrostu mogą by rozwiązaniem alternatywnym dla antybiotyków. W żywieniu zwierząt stosuje się najczęściej probiotyki zawierające bakterie z rodzaju Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus oraz drożdże Saccharomyces cerevisiae (w ilości od 105 do 109 CFU/g)

DROBNOUSTROJE W PREPARATACH PROBIOTYCZNYCH DLA ZWIERZĄT MIKROORGANIZMY Lactobacillus acidophilus Enterococcus faecium Bifidobacterium bifidum Lactobacillus acidophilus Enterococcus faecium Lactobacillus acidophilus, Lb. brevis, Lb. casei, Lb. fermentum, Lb. lactis, Lb. plantarum Bacillus subtilis, B. megaterium, B. pumilus Enterococcus faecium Cellulomonas sp. Saccharomyces cerevisiae Bifidobacterium bifidum Lactobacillus amylovorus Enterococcus faecium Saccharomyces cerevisiae CBS 493. 94 NAZWA HANDLOWA PREPARATU PRZEZNACZENIE Acid-Pak-4 -Way Wacter drób, indyki rzeźne świnie Biogen T prosięta tuczniki warchlaki Cerbiopor maciory loszki prosięta tuczniki warchlaki Probiomix cielęta drób Probiosacc C-I cielęta Yea Sacc bydło

WŁAŚCIWOŚCI DROBNOUSTROJÓW PROBIOTYCZNYCH Produkcja i wydzielanie enzymów hydrolitycznych Produkcja substancji antybakteryjnych, (kwasy organiczne, nadtlenek wodoru, bakteriocyny) „Podsiadanie” patogena Wspomaganie układu immunologicznego

Produkcja i wydzielanie enzymów hydrolitycznych Jednym z podstawowych składników pasz pochodzenia roślinnego są polisacharydy, które - ze względu na odporność na działanie enzymów trawiennych – są trudno przyswajalne. Niektóre z nich (np. celuloza i lignina) są nierozpuszczalne w wodzie i wiążą dużą jej ilość, co powoduje zwiększenie objętości treści pokarmowej w jelicie cienkim. Inne (np. pektyny i część hemiceluloz) rozpuszczają się w wodzie, przez co pęcznieją w jelicie cienkim tworząc lepkie żele, co wydłuża czas przechodzenia treści przez przewód pokarmowy. Ponadto, absorbują niektóre substancje hamując wchłanianie niektórych składników paszy. U młodych zwierząt, żywionych paszą zawierającą znaczny udział rozpuszczalnych niestrawionych węglowodanów, obserwuje się pogorszenie wskaźników produkcyjnych, a niekiedy także niedobór witamin i składników mineralnych. Drobnoustroje probiotyczne wytwarzają różne enzymy rozkładające węglowodany, takie jak beta-glukany. Zwiększają również aktywność enzymów własnych gospodarza, np. beta-galaktozydazy, sacharazy i maltazy. Dzięki nim zwierzęta lepiej przyswajają paszę. Jest to bardzo ważna cecha, ponieważ w związku z zakazem stosowania w żywieniu zwierząt mączek zwierzęcych, pasze roślinne nabierają jeszcze większego znaczenia.

Produkcja substancji antybakteryjnych, (kwasy organiczne, nadtlenek wodoru, bakteriocyny) • Kwasy organiczne (mlekowy i octowy) – ich antybakteryjny wpływ wynika przede wszystkim z gwałtownego obniżenia p. H poza zakres optymalnej wartości dla wzrostu oraz z hamowania aktywności biochemicznej mikroorganizmów przez niezdysocjowane cząsteczki kwasu. Hamują wzrost bakterii proteolitycznych, pałeczek Gram-ujemnych, drożdży i pleśni. • Nadtlenek wodoru - niektóre szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus wytwarzają go w ilościach nie tolerowanych przez patogeny. Hamuje on rozwój lub zabija mikroorganizmy, które nie posiadają albo mają niski poziom enzymów, takich jak peroksydaza, katalaza czy dysmutaza nadtlenkowa, chroniących przed utlenieniem mostków dwusiarczkowych w białkach komórkowych. • Bakteriocyny – białka wytwarzane i wydalane poza komórkę przez liczne szczepy bakterii (np. Lactobacillus sp. , Enterococcus faecium, Lactococcus lactis czy Streptococcus thermophilus), które działają bójczo lub hamują wzrost wrażliwych drobnoustrojów. Od antybiotyków różni je bardziej "swoiste" działanie, obejmujące tylko niektóre gatunki, podczas gdy antybiotyki niszczą wiele grup bakterii. Miejscem uchwytu jest błona komórkowa bakterii posiadających odpowiednie dla nich receptory. Najbardziej znane bakteriocyny wytwarzane przez bakterie fermentacji mlekowej to: nizyna, acidolina, acidofilina, lactacyna, lactocydyna, reuteryna, laktolina i enterocyna. Wykazują one wysoką aktywność bakteriobójczą wobec różnych patogenów, takich jak E. coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus sp. , Listeria sp. , Klebsiella sp. , Proteus sp.

„Podsiadanie” patogena Dzięki zdolności przylegania (czyli adhezji) do powierzchni błony śluzowej przewodu pokarmowego, drobnoustroje probiotyczne zasiedlają miejsce, które mógłby zająć patogen. Wiele z nich posiada specjalne „przyssawki” – fimbrie, za pomocą których trwale wiąże się z receptorami śluzówki. Ta właściwość jest szczególnie istotna w przypadku noworodków, u których w pierwszych godzinach życia przewód pokarmowy jest jałowy. Zanim wyprodukuje on własne przeciwciała – w walce z patogenem pomagają mu „dobre mikroby”, które w błonie śluzowej utworzą coś w rodzaju warstwy ochronnej.

Wspomaganie układu immunologicznego Drobnoustroje probiotyczne stymulują wytwarzanie przeciwciał u gospodarza, a także wpływają na podwyższoną aktywność innych elementów układu odpornościowego (np. limfocytów i makrofagów). Dzięki składnikom ściany komórkowej bakterii mlekowych, makrofagi produkują zwiększoną ilość substancji zdolnych do niszczenia patogenów.