METABOLISMO Estequiometria e balano de fluxos em perspectiva

METABOLISMO Estequiometria e balanço de fluxos (em perspectiva sistêmica) Notas de Aula Manuel Mateus Ventura Brasília, 2006

• METABOLISMO • Estequiometria e balanço de fluxos • (em perspectiva sistêmica) • Notas de Aula (apresentação em MS - ppt) por Manuel Mateus Ventura • Brasília, 2006 2

• Estas notas de aula visam apresentar aos • • • estudantes de graduação e, particularmente, aos de pós-graduação, na área de Biologia, um dos tópicos de maior relevância teórica e prática, que se insere em Biologia de Sistemas. São um esforço didatização. • venturamm@unb. br (para contacto). • Disponível em www. manuelmateusventura. pro. br • jun-2006 corrigido em 11 -08 -2006 3

REAÇÕES QUÍMICAS • Reações químicas ocorrem quando moléculas que se encontram alteram suas composições e estruturas com reordenação de seus átomos constitutivos e surgimento de outra(s) molécula(s). 4

REAÇÕES QUÍMICAS 2 • Equação estequiométrica: indica as es – pécies que participam da reação (reagen tes e produtos) e suas proporções mole culares relativas (estequiometria): a 1 A 1+ a 2 A 2+. . . +an. An = b 1 B 1+ b 2 B 2 +. . . +bm. Bm ou, de forma mais compacta, ∑r ar. Ar -∑P b. PBP = 0 r = 1, 2, . . . , n p = 1, 2, . . . , m 5

Equações de reações • ∑ij aij. Xj = 0 R 1 R 2 i = 1, . . . , m reações j = 1, . . . , n espécies a 11 X 1 + a 12 X 2 +. . . + a 1 n. Xn = 0 a 21 X 1 + a 22 X 2 +. . . + a 2 n. Xn = 0 ------------------------------- Rm am 1 X 1+ am 2 X 2+. . . + amn. Xn = 0 6

• A equações estequiométricas em forma matricial: a 11 a 12. . . a 1 m X 1 a 22. . . a 2 m ∙ X 2 = ---------------- --- an 1 an 2. . . Xm anm a 11 X 1 + a 12 X 2 +. . . + a 1 m. Xm a 21 X 1 + a 22 X 2 +. . . + a 2 n. Xm = 0 0 = 0 -------------------------- am 1 X 1+ am 2 X 2 +. . . + amn. Xm 0 7

• Conservação de elementos A equação estequiométrica deve ser balanceada para os elementos que constituem as espécies moleculares (reagentes e produtos) que participam da reação. Os elementos conservam seus números atômicos Z. 8

Matriz de elementos: Cada de seus elementos dá o número de átomos de um elemento químico por molécula de reagente ou produto. Exemplo, a seguir. 9

• Consideremos a reação: GLICOSE(G) + ATP = G 6 P + ADP + H+ Matriz de elementos: G ATP G 6 P ADP H + H+ C E = O N P 12 6 6 0 0 13 10 13 5 3 12 6 9 0 1 13 10 10 5 2 10

• Conservação da carga: Em uma reação deve haver balanço de carga elétrica. Matriz de carga: para a reação anterior, tem-se G ATP G 6 P ADP H+ Cel = 0 -4 -2 -3 1 11

• • • Redes de reações químicas Estamos habituados a ver seqüencias de reações que se ramificam ao nível de espécies moleculares que participam das transformações químicas. Por exemplo: E A B C F D 12

• • • Nessas redes, distinguem-se nós ou vértices, em correspondência às espécies moleculares e conexões ou arestas que indicam as transformações químicas entre os nós. Em sistemas muito complexos, como os do metabolismo celular, as redes de multirreações interconectadas podem ter tamanho enorme, constituidas por milhares de nós e conexões. 13

• Redes biológicas são representações abstratas de sistemas biológicos, que apresentam muito das propriedades fundamentais desses sistemas. De tais características, destacam-se: a)modularidade, b)robustez ou resiliência e c)recorrência na utili • zação de certos elementos. 14

• Redes de moléculas e reações entre elas são o centro da atividade celular, a qual resulta, no todo, da combinação de todas essas redes (metabolismo e seu controle, sinalização, expressão gênica etc. ) 15

• A arquitetura (topologia) de uma rede relaciona-se à sua robustez ou resiliência, ou seja, a capacidade de resistência aos agentes externos e internos que podem afetar ou destruir a integridade da rede. 16

• Redes biológicas são sistemas dinâmicos, i. e. , seu estado global evolui no tempo. • A dinâmica de uma rede depende dos estados internos atingidos pelos seus vértices e sua evolução temporal. 17

• O estudo de redes como um todo está a levar à descoberta de propriedades e princípios gerais válidos para as mais diversas redes, inclusive biológicas. Para esse fim, a contribuição de físicos tem sido relevante, por meio de uma ferramenta adequada- a mecâ – nica estatística. 18

• A representação de sistemas biológicos por redes tem a vantagem de permitir o uso de conceitos e procedimentos da teoria dos grafos, a qual tem sido muito usada em tecnologia. 19

• • • GRAFOS: representação simbólica de interações ou transformações entre quaisquer entidades(moléculas, elementos em crcuitos elétricos, indivíduos em uma população, ecossistema ou grupo social, emissores e receptores de informação etc. ). • Grafos são entidades matemáticas. 20

METABOLISMO • O metabolismo da célula viva é uma rede (“network”) de interconversões de espécies químicas pela qual a célula obtém os blocos estruturais e a energia necessários à sua organização estrutural e funcional. É um conjunto de reações químicas conectadas e integradas, caracterizado por uma topologia e uma dinâmica. As reações são, em geral, catalisadas por enzimas. Além de reações, podem ocorrer processos de transporte. 21

Genética Proteínas Metabolismo Sinalização Biologia Celular Química - Computação- Biologia de sistemas 22

• ERA PÓS-GENÔMICA (dados produzidos em alto fluxo por NMR, MS, 2 d-gel, DNA arrays, two-hybrids technique etc. ) (com base no Dagstuhl Seminar on • Integrative Bioinformatics 2004) • segue 23

• • BIOLOGIA MOLECULAR • Meta- OGE bolismo PRR Prote. Transômica criptômica OGE: organização genômica estrutural Metabo- PRR: padrões de regiões regulatórias lômica 24

CERCA DE 600 BASES DE DADOS E VÁ RIAS FERRAMENTAS ANALÍTICAS DISPONÍVEIS NA WEB CIÊNCIA DA COMPUTAÇÃO TAREFAS BIOLÓGICAS ( MÈTODOS E (EXPERIMEN- CONCEITOS) TAIS) 25

• • A N Á L I S E (extração de informação) integração desafio BIOINFORMÁTICA INTEGRATIVA (novos níveis de entendimento) CÉLULA VIRTUAL 26

• • • O funcionamento de uma célula envolve um sistema altamente complexo de processos químicos interconectados, o metabolismo, cuja reconstrução, constitui a meta final da biologia de sistemas. 27

Metabolismo decompõe nutrientes em moléculas mais simples e energia (catabolismo); sintetisa moléculas orgânicas complexas (anabolismo), as quais são a base estrutural e funcional da célula. Metabolismo compreende: - reações químicas catalisadas por enzimas - metabolitos: pequenas moléculas consumi das e produzidas nos processos químicos. 28

• Dado o papel relevante das enzimas, po – de-se dizer que o metabolismo celular é a expressão bioquímica (fenótipo bioquímico) do genoma. 1 - Uma enzima pode catalisar mais de uma reação química (promiscuidade de substrato); as reações catalisadas apresen – tam, geralmente, similaridade. 2 – Enzimas podem ser formadas por mais de uma cadeia peptídica e constituir oligômeros. 29

3 – Mais de uma enzima podem catalisar a mesma reação química. Assim, o número de enzimas não corres – ponde ao número de genes que as codifi cam e ao número de reações catalisadas. 30

• O METABOLISMO E SUA RE • GULAÇÃO SÃO AS FUNÇÕES • MAIS FUNDAMENTAIS DE UMA CÉLULA 31

• RECONSTRUÇÃO METABÓLICA • • identifica, categoriza e interconecta genes, proteínas, reações e metabolitos que participam do metabolismo de um sistema biológico para constituir uma rede, a qual pode ser usada como base para caracterizar crescimento e predizer fenótipos celulares. 32

• Reconstrução metabólica • GENOMA • SEQUENCIAMENTO (base de dados) • ANOTAÇÃO • (identificação de segmentos codificantes+ • dados bioquímicos e fisiológicos) • • RECONSTRUÇÃO da rede metabólica e regulatória 33

A modelagem e simulação de redes • metabólicas são de grande relevân • cia para o entendimento quantitati • vo do metabolismo de um micro • organismo e servem ao aperfeiçoa • mento deliberado das capacidades • metabólicas por meio das técnicas • de DNA recombinante (engenharia • metabólica). 34

SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS: VANTAGENS: podem mostrar a não viabilidade de hipóteses aparentemente plausíveis e, ao confirmarem uma hipótese, podem prover predições quantitativas e mesmo direcionar o trabalho experimental. Entretanto, não se deve esquecer de que usam modelos e são simulações. 35

• • • A enorme massa de dados de que se dispõe e que resulta de técnicas analíticas de alto fluxo (“high throughput”) está a exigir o aperfei çoamento intenso e contínuo de algorítmos que possibilitem o tratamento computacional para atingir o entendimento integrado da dinâmica celular (tecnologias- “omics”). 36

• • Os dados que resultam do tra balho experimental com células vivas constituem a base para trabalhar com a modelagem computacional do metabolismo. Simulação e modelagem, contudo, são de relevância em conseguir, a partir desses dados, visão mais pene • trante da dinâmica dos sistemas em • estudo. 37

• • • Para ter em mente ! “The important thing in science is not so much to obtain new facts as to discover new ways of thinking about them. ” Sir William Bragg 38

• ABORDAGEM CINÉTICA • NO ESTUDO DO • METABOLISMO 39

• • A expressão das velocidades de reações químicas por equações diferenciais, com base na lei de ação das massas, tem possibilitado o estudo da evolução no tempo de sistemas metabólicos não muito complexos, i. e. , em escala subgenômica. 40

Tem sido o procedimento adotado na cinética enzimática, para o estudo de enzimas individuais ou em pequeno número. Exige que sejam conhecidas as constantes de velocidade das reações envolvidas, o que representa grande obstáculo no estudo de redes metabólicas complexas, em escala genômica. 41

• Contudo, • eritrócito e mitocôndrio têm tido seus metabolismos estudados por via cinética. 42

Para a reação k 1 a. A + b. B c. C + d. D, k-1 tem-se v = - (1/a)d[A]/dt = - (1/b)d[B]/dt = 1/c)d[C]/dt = (1/d)d[D]/dt v = velocidade da reação k 1, , k-1 = constantes de velocidade 43

• As equação cinética será v = v - v = k 1[A]α [B]β - k-1[C]γ [D]δ onde os expoentes indicam a ordem cinética relativa a cada reagente; a ordem cinética da reação, n = α + β + γ + δ. Note-se que as ordems cinéticas podem não ser necessariamente Iguais aos respectivos coeficientes estequiométricos. 44

• Seqüências de reações. Seja o seguinte caso simples: k 1 k 2 X 1 X 2 X 3 X 1´= d. X 1/dt = - k 1[X 1] X 2´= d. X 2/dt = k 1[X 1] – k 2[X 2] X 3´= d. X 3/dt = k 2[X 2] [X 1]0 + [X 2]0 + [X 3]0 = [X 1]t + [X 2]t + [X 3]t estado estacionário: X 1´= X 2´= X 3´= 0 45

• No estado estacionário, os fluxos de reação não se anulam, como no equilíbrio, mas compensam-se de tal modo que d. Xi/dt = 0. Neste caso, as equações diferenciais da cinética convertem-se em um sistema de equações algébricas simultâneas. 46

• Integração das equações cinéticas: • - em forma analítica ou exata, possível somente em casos especiais; • - por métodos numéricos, aproxima • dos e computacionais 47

• Equações cinéticas para sequências de reações, lineares ou ramificadas, podem ser obtidas pelo método computadorizado de King- Altman, bem conhecido em cinética enzimática. 48

• • • Programas para o estudo cinético do metabolismo: dos inúmeros disponíveis, indicaremos os seguintes: GEPASI Pedro Mendes 1989 2002 //www. gepasi. org; E-cell 2 Keio University; Cell. Designer V. 2. 26 2003 -2005 The Systems Biology Institute //www. celldesigner. org 49

MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA S um conceito básico em análise do metabolismo 50

Matriz estequiométrica (S) • Smn é uma matriz de ordem mxn, onde m filas correspondem ao número de espécies químicas (substratos e produtos) e n colu – nas indicam o número de reações envolvendo essas espécies. Os elementos de S são os coeficientes estequiométricos aij das espécies que correspondem às filas i e colunas j i = 1, 2, . . . , m j = 1, 2, . . . , n S = aij < 0 substratos aij >0 produtos aij = 0 51

UM IMPORTANTE CONCEITO O conceito de matriz estequiométrica é es – sencial para representar e analisar mate – maticamente os sistemas metabólicos. Possibilita o uso da álgebra linear, inclusive da análise convexa, em bioinformática e biologia computacional. 52

Matriz estequiométrica 2 S = R 1 R 2 Rn a 11 a 12. . . a 1 n a 21 a 22. . . a 2 n reações j = 1, . . . , n espécies químicas i = 1, . . . , m ---------------- am 1 am 2. . . amn aij : coeficientes estequiométricos aij < 0 substratos aij > 0 produtos aij = 0 a espécie molecular i não participa da reação j 53

• Na matriz estequiométrica, como definida aqui, temos: a)as filas de S representam as espécies químicas (substratos e produtos); b)as colunas de S indicam as reações; c)os elementos de S são os coeficientes estequiométricos aij com sinal negativo para substratos e positivo para produtos. aij = 0 indica que a espécie i não partici – pa da reação j. 54

• Subespaços de S: a 11 a 12. . . a 1 n S = a 21 a 22. . . a 2 n espécies: 1, . . . , m reações: 1, . . . , n ---------------- am 1 am 2. . . amn S pode ser representada tanto pelos vetores coluna quanto pelos vetores fila: r. T 1 a 1 k S = c 1. . . cn =. ck =. ri =. . r. T m amk ai 1. . . ain 55

Subespaço de vetores coluna: é determinado pelo conjunto de vetores coluna de S e denotado por R(S) determina o espaço de concentração dinâmico. Os vetores coluna, que correspondem às reações químicas da rede metabólica considerada e que constam de S, contribuem para as variações das concentrações dos metabolitos. 56

Subespaço de vetores fila: é determinado pelo conjunto de vetores fila. e denotado por R(ST). No espaço de fila estão as variações de concentração que contribuem às taxas de fluxo das reações. 57

• • • Posto (“rank”) de uma matriz, r. Definição. O posto de uma matriz A é a ordem da maior sub-matriz quadrada cujo determinante não é nulo. Ex. : 3 0 3 A= 2 4 6 det. A = 2 4 6 = 1 5 6 = 3 4 6 + 3 2 4 5 6 1 5 = 0 • O posto de A não pode ser 3, pois det. A = 0, mas • é igual a 2, como se pode ver. 58

• Proposição. O posto da matriz A é igual à dimensão do subespaço de seus vetores coluna ou vetores fila: posto. A = dim. R(A) = dim. R(AT) = r 59

• ESPAÇO –N U LO DE S Definição. O espaço –n u l o (direito) da matriz S é o conjunto de todas as soluções v 1 v =. . . = v 1. . . Vn T vn das soluções do sistema de equações Sv = 0, o qual corresponde ao estado estacionário. 60

O espaço-n u l o é um subespaço e é denotado por N(S) ou nulo(S). Se r = posto de Smn, tem-se dim. N(S) = n-r , N(S) ┴ R(ST) N(S) determina o espaço que compreende os caminhos de estado estacionário da rede metabólica considerada. 61

• Espaço-nulo (esquerdo) de Smn é o con – junto das soluções y 1 y =. . . = y 1. . . ym T ym do sistema de equações S Ty = 0. É denotado por L = N(ST) ou nulo(ST) e tem-se dim(ST) = m-r , N(ST) ┴ R(S). 62

• Seja a equação de balanço dinâmico dx/dt = Sv = 0 e multipliquemos ambos os membros por L: Ldx/dt = LSv = 0 Ldx/dt = 0 Lx = const. A última expressão indica que os vetores de L definem as relações de conservação entre concentrações de metabolitos em uma rede metabólica. 63

Matriz de espécies (reagentes e produtos) Vetor coluna: • • Xm = X 1 X 2 . . . Xm T 64

• CONSERVAÇÃO DE ELEMENTOS • Seja a reação G+ATP = G 6 P+ADP+H+ G ATP G 6 P ADP S = -1 -1 1 1 H C O N P 12 13 6 10 6 13 9 10 0 5 0 3 1 2 . -1 -1 1 1 = 0 0 = 0 E ∙ ST = 0 65

• CONSERVAÇÃO DA CARGA ELÉTRICA • G ATP G 6 P ADP S = -1 -1 1 1 Cel= 0 -4 -1 -3 Cel ∙ ST = 0 A ortogonalidade entre Cel e ST indica a conservação da carga. 66

MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA: um exemplo mais complexo • Uma seqüência de reações da glicólise: R 1 Glicose(G) + ATP = G 6 P + ADP + H+ R 2 G 6 P = F 6 P R 3 F 6 P + ATP = FBP + ADP + H+ R 4 FBP = 63 P + DHAP R 5 2 G 3 P + NAD+ + Pi= BPG + NADH + H+ S, a seguir 67

R 1 G ATP ADP G 6 P FBP G 3 P DHAP BPG NAD+ NADH Pi H+ -1 -1 1 R 2 R 3 R 4 R 5 -1 1 1 1 -2 = S 1 -1 1 Posições em branco correspondem a zeros. 68

S de uma rede metabólica • X 1 X 2 • • R 1 R 2 • X 1 -1 • X 2 1 -1 • X 3 1 • X 4 • X 5 • X 6 • X 7 X 3 X 4 R 3 X 5 X 6 R 4 X 7 R 5 R 6 R 7 -1 -1 1 69

Conectividades em S • S é uma matriz que conecta todas as espécies químicas (metabolitos) que partici – pam de um determinada sistema metabóli – co. Propriedades de conectividade. - Número de participação: número de vezes que um metabolito participa das - reações do sistema. É, no mínimo, 2 para - Metabolitos internos. - Número de moléculas em uma reação: soma - de todos os coeficientes estequiométricos na equação - de uma reação. 70

Partição de S • A matriz estequiométrica plena S abrange reações internas (n) e metabolitos internos (m) da célula que correspondem a uma partição denotada por Sint. Entretanto, outras partições ou subpartições podem ser consideradas, como para substratos, produtos, Intermediários metabólicos, constituintes de biomassa e reações de troca entre organeloas e outros compartimentos da célula. 71

Partição de S Sint S = Sext 72

Partição de S: exemplo específico R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 R 8 Glicose -1 subtratos ------------------------------------Succin. . 1 Lactato 1 H 2 1 produtos Acetato 1 etanol 1 -------------------------------------PEP 2 -1 -1 NAD+ -1 2 NADH 1 -2 -1 -2 intermediários CO 2 -1 1 ATP 1 1 Acetl-Co. A 1 -1 -1 73

• • • No sistema metabólico da célula, as espécies químicas que participam das várias reações são distinguidas como a) substratos, b) produtos metabólicos, c) metabolitos intermediários e d) produtos de biomassa. O termo metabolito, freqüentemente, tem significação abrangente. 74

• • • Coeficientes estequiométricos: αij para substratos Xs ; βij para produtos metabólicos Xp; γij para constituintes de biomassa Xb; gij para metabolitos intermediários Xint. Para as j reações, tem-se ∑j ∑i αij. Xs + ∑j ∑i βij. Xp + ∑j ∑iγij. Xb + ∑j ∑igij. Xint =0 A seguir, em forma matricial : 75

• Estequiometria global da célula em forma • matricial: ATXs + BTXp+ ΓTXb + GTXint = 0 ou ainda, por partição da matriz estequio – métrica única para o sistema. • • ST ---------- • --------------- • • -------------------- Xs Xp = 0 Xb Xint 76

REAÇÕES E FLUXOS • As reações químicas do metabolismo podem ser vistas como fluxos de matéria associados a trocas de energia e processos de transporte. Ao serem referidas, reações são quase sempre tomadas como os fluxos que ocorrem através delas. As redes metabólicas são fluxos interconectados que a célula viva mantém sob controle por me – canismos de modulação enzimática (ativação e inirição) e regulação da expressão de genes. 77

Fronteiras em sistema metabólicos • Sistemas metabólicos podem ser delimi – tados por fronteiras, físicas ou não. Ao ser definida a fronteira, tem-se - interior, onde está o sistema metabólico considerado; - exterior. Fluxos internos ocorrem no interior e fluxos externos entre o interior e o exterior. 78

Rede metabólica • • • v 6 v 3 b 1 v 1 A • • v 2 B b 2 D E F G v 4 C v 5 v 7 b 3 fronteira 79

• Matriz estequiométrica da rede: • R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 b 1 b 2 b 3 • -1 • 1 -1 • S= 1 -1 • • 1 • -1 -1 A B C D E F G 80

• Vetor de concentração • • x 1 x = x 2. . . xm Vetor de fluxo v 1 v 2 v 3 v = v 4 v 5 v 6 v 7 b 1 b 2 b 3 81

O vetor de fluxo é função das concentra – ções e das constantes cinéticas k das reações: v = v (kj) j = 1, 2, . . . , n kj são parâmetros experimentais de difícil determinação e nem sempre disponíveis. As velocidades de reação são funções não lineares das concentrações dos metabolitos, na forma dada na cinética química. 82

• • Equação de balanço dinâmico : dx/dt = S ∙ v Estado estacionário: dx/dt = S ∙ v = 0 • Metabolitos intermediários não variam • suas concentrações dentro do intervalo de tempo dos experimentos. São consumi • dos na mesma taxa em que são produzi • dos. 83

• • • O estado estacionário, onde d. Xi/dt = 0, é uma idealização, matematicamente vantajosa. A escala de tempo dos processos enzimáticos, comparada com a dos vários pro – cessos fisiológicos, justifica a aproxima – ção do estacionário. O tempo t não está presente nas equa – ções de balanço do estacionário. 84

dx/dt = S ∙ v = 0 R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7 b 1 b 2 b 3 • -1 1 -1 1 -1 -1 v 1 -v 1 -b 1 v 2 v 1 -v 2 v 3 v 2 -v 3+v 4 -v 5 v 4 v 3 -v 4 -v 6 v 5 = v 7 -b 2 v 5 -v 7 v 6 v 7 -b 3 b 1 b 2 b 3 85

• • A consideração do estacionário permite substituir sistemas de equações diferenciais em sistemas de equações algébricas lineares. As derivadas dx/dt não mais aparecem. 86

• Para ilustração, tome-se a rede metabólica (grafo) simples: • • b 1 v 1 X 1 v 2 b 2 v 3 X 2 v 4 X 3 87

• • O balanço de fluxo em estado estacionário: dx/dt = S ∙ v = o Xi´ = d. X 1´/dt v 1 X 1´ -1 -1 0 0 -1 0 v 2 0 X 2´ = 1 0 1 -1 0 -1 v 3 = 0 X 3´ 0 1 -1 1 0 0 v 4 0 b 1 b 2 88

• • • -1 -1 0 0 -1 0 1 -1 1 0 0 v 1 v 2 -v 1 -v 2 -b 1 v 3 = v 1+v 3 -v 4 -b 2 v 4 v 2 -v 3+v 4 b 1 b 2 89

• Balanço de fluxos em estado estacionário • • • d. X 1/dt = -v 1 -v 2 -b 1 = 0 d. X 2/dt = v 1+v 3 -v 4 -b 2 = 0 d. X 3/dt = v 2 -v 3+v 4 = 0 90

• RESTRIÇÕES ADICIONAIS • Sobre fluxos internos: • vj ≥ 0 j = 1, . . . , n • Sobre fluxos externos: • exterior sistema bj ≤ 0 • exterior sistema bj ≥ 0 91

• CONE DE FLUXOS • n >> m : o número de reações • excede de muito o número de • metabolitos, o que correspon – • de a dizer que o número de • colunas de S é muito maior do • o número de filas. 92

• Os sistemas de equações line • ares homogêneas formados • pelas equações de balanço di • nâmico do estacionário, • S ∙ v = 0, • têm um número infinito de solu • ções em seu espaço-nulo. 93

• • • Ao tomar em conta as restri – ções (inequações) impostas ao sistema, a análise convexa mostra que o espaço de solução é um cone poliédrico comvexo, o qual contém todos os pontos do espaço-nulo de coordenadas não negativas, mais os pontos correspondentes aos fluxos externos de coordenadas negativas. 94

• Palsson & Schuster propõem • que o espaço inteiro de fluxo, • no qual estão contidas as so • luções do sistema, representa • a capacidade da rede metabó • lica considerada. 95

• CONE DE FLUXO (estado estacionário) p 1 p 3 p 2 p 4 pi arbitrários, somente para ilustração 96

• • “Caminhos extremos” (extreme pathways) Constituem um número míni – mo de vetores que, por combinação linear, podem gerar qualquer vetor do cone de fluxo: v = ∑i wipi , wi ≥ 0 , i = 1, . . . , k 97

• • • Caminhos extremos: são as arestas do cone poliédri – co; não podem ser representados por combinações de quaisquer outros vetores do cone, lembrando o que ocorre com os vetores de base de um espaço vetorial; são “conicamente independentes” (Schilling). 98

• Caminhos extremos: • qualquer vetor do cone polié • drico pode ser representado • por combinação linear não ne • gativa dos vetores de caminho • extremo. 99

• Cada caminho-extremo de um • cone poliédrico corresponde a um conjunto de fluxos que sa • tisfaz à equação de balanço • de massa mais as restrições. 100

• Restringindo o cone de estado • estacionário: • vimos que esse contem • um número infinito de solu – • ções; • somente algumas soluções • têm significação fisiológica. 101

• • • Restrições relativas a fluxos externos têm que ser consideradas, além das que já foram citadas, tais como o organismo, ambiente, disponibilidade de substratos, transporte por difusão e outras. Todas essas restrições resultam em diminuição do espaço de fluxo. 102

• DISTRIBUIÇÃO OTIMIZADA • DE FLUXOS • pode ser computada com re • lação a uma certa função-objeti • vo, linear, Z = ∑j cjvj. 103

• Escolhida a função-objetivo Z, • a otimização (minimização/maxi • mização) de S∙v =0 + restrições é um problema de • programação linear (PL), geral – • mente resolvido pelo algorítmo • simplex. 104

• • • A escolha de Z: a função Z deve atender à maximização (ou minimização) de uma determinada característica da rede metabólica: crescimento celular (max. ); concentração de um determinado metabolito (max. /mini. ); demanda de energia (mini. ) etc. 105

Determinação dos caminhos extremos de uma rede metabólica pelo algorítmo de Shilling: Schlling, C. H. , Letscher, D. and Palsson, B. O. 2000. J. theor. Biol. 203: 229 -248. 106

• Retome-se a rede metabólica (grafo): • • b 1 v 1 X 1 v 2 b 2 v 3 X 2 v 4 X 3 • e, a seguir, sua matriz S. 107

• v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 • X 1 -1 -1 0 0 -1 0 • S = X 2 1 0 1 -1 0 -1 • X 3 0 1 -1 1 0 0 • 3 metabolitos • 4 fluxos internos, 2 fluxos externos 108

• Matriz inicial: ST unida a I 4 x 4 • X 1 X 2 • 1 -1 1 • T(0)= 1 -1 0 • 1 0 1 • 1 0 -1 • T(E) 1 -1 0 • 1 0 -1 X 3 0 1 -1 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 109

• Na matriz inicial, identificar os metabolitos que não têm fluxos externos a eles associados e cujo número é denotado por μ. O metabolito X 3, como se pode ver, é o único a não estar associado a um fluxo externo. Assim, tem-se μ = 1. A seguir, forme-se uma nova matriz por cópia de todas as filas de T(0) que contenham um zero na coluna de ST que corresponda a X 3. No caso presente, copia-se somente a 1 a. fila. Em continuação, sejam adicionadas todas as combinações possíveis, de tal modo que se tenha zero na coluna que corresponde a X 3. 110

• Do procedimento anterior, tem-se • X 1 X 2 X 3 • 1 -1 1 0 v 1 • 1 1 -1 1 0 v 2 • T( μ) = 1 1 0 0 0 v 3 • • • 1 1 -1 0 0 -1 b 2 111

• • • A partir da matriz T(μ), é formada a matriz final T(final): v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 p 1 1 0 0 0 -1 1 T(final)= p 2 0 1 1 0 -1 1 p 3 0 0 1 1 0 0 donde os caminhos extremos: p 1 = v 1 – b 1+b 2 , p 2 = v 2 + v 3 -b 1+b 2 p 3 = v 3 + v 4 112

• • • Exemplo Verifique se o vetor v = 5 2 3 -3 6 1 T está contido no cone de fluxo da rede metabólica em consideração • • p 1 p 2 p 3 v 1 1 0 0 v 2 0 1 0 v 3 0 1 1 v 4 0 0 1 b 1 -1 -1 0 b 2 1 1 0 5 2 3 0 -3 = 0 6 0 1 113

• Rede metabólica (grafo): • • b 1 p 2 v 1 X 1 v 2 X 3 p 1 b 2 X 2 v 3 v 4 p 3 • com “caminhos extremos” indicados 114

MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA Análise por DECOMPOSIÇÃO DE VALOR SINGULAR (SVD) Por conveniência, é usada a abreviação em inglês. 115

• DECOMPOSIÇ O DE VALOR • SINGULAR (SVD) DE UMA • MATRIZ. • Definição matemática. • Seja Amxn uma matriz de elementos reais, • geral. • • • A decomposição de valor singular de Amxn é a fatoração A = Umxm∑mxn(Vnxn )T, onde Umxm = “matriz de vetores singulares esquerdos”, ∑mxn= matriz diagonal e Vnxn= “matriz de vetores singulares direitos”. 116

• • • Os elementos da matriz diagonal ∑mxn são os valores singulares: σ1≥ σ2 ≥. . . ≥ σn , os quais são as raizes quadradas (não nulas) dos autovalores (eigenvalores) de AAT e ATA. U contém o espaço de coluna e o espaço nulo esquerdo. V contém o espaço de fila e o espaço nulo de A. O espaçp de fila contém informação termodinâmica. 117

Colunas de U e V fornecem bases orto – normais para os 4 subespaços fundamen – tais de S. As primeiras colunas de U e V fornecem bases ortonormais para os espaços de co – luna e fila, respectivamente. As restantes m-r colunas de U dão uma base ortonormal para o espaço-nulo esquerdo. As n-r colunas de V dão uma base orto – normal para o espaço-nulo. 118

• Mapeamento entre vetores singulares • S = U ∑ VT • SV = U ∑ VTV = U ∑ • Svk = σkuk • S mapeia o vetor singular direito sobre o vetor singular esquerdo por • meio do valor singular correspondente. 119

• • SVD tem aplicações em várias áreas de ciência e técnica e pode ser usada para Identificar e caracterizar os aspectos bioquímicos dominantes da rede metabólica. SVD mostra aspectos interessantes e de utilidade da matriz decomposta, os quais não são aparentes na matriz original. A análise de S por SVD, a despeito de não tratar explicitamente da dinâmica da • rede considerada, fornece informação • topológica sobre relações sistêmicas entre 120 • metabolitos e fluxos.

• • • SVD torna evidentes aspectos úteis e importantes da matriz decomposta, os quais não podem ser vistos diretamente a partir da matriz original. As matrizes componentes U, ∑ , V são, em geral, ortogonais e independentes. Os vetores singulares(modos) são ortonormais. UTU = Imxm VTV= Inxn 121

• Combinação linear de metabolitos e de fluxos. • dx/dt = S∙v S= U∑VT multiplicando por UT • • UT dx/dt = UTU∑VTv = ∑VTv • d(uk. Tx)/dt = σk(vk. Tv) k = 1, . . . , r • r : posto de S ; uk : vetor sing. esquer; • Vk : vetror singular direito. 122

• Continuação Do procedimento anterior, vemos que há uma combinação linear de fluxos vk. T∙ v = vk 1 v 1 + vk 2 v 2 +. . . + vkn vn que movimenta uma combinação linear de Metabolitos. Os vk são contrbuições de eigenreações. uk. T∙ u = uk 1 x 1 + uk 2 x 2 +. . . + ukr xm em uma extensão dada por σk (valor singular). Os uk equivalem aos coeficientes este quiométricos sistêmicos. 123

Desde que, em SVD, os vetores singulares são ortonormais um ao outro, cada dos k movimentos é desacoplado dos demais. Então, a combinação linear de concentrações dada para uk. T∙u pode ser considerada como uma reação sistêmica desacoplada e impul – sionada pela combinação linear de reações definidas em vk. T∙ v. As reações metabólicas sistêmicas ou eigenreações podem descrever a rede metabólica como um todo. 124

• Seja • • U ∑ VT SV = U ∑ VT V = U ∑ • Assim, tem-se Svk = σkuk • o que significa que S mapeia o vetor singu • lar direito sobre o vetor singular esquerdo, por meio do valor singular relativo. 125

• Tratamento semelhante ao dado acima tem sido usado em análise de expressão de genes por SVD. Alter, O. , Brown, P. O. , Botstein, D. Singular Value decomposition for genome-wide expression data processing and modeling. PNAS 97(18) 10101 -10106 (2000) 126

• Computação dos valores singulares • Tomemos uma simples reação de isome • rização que consiste na interconversão • v 1 • AB BA ou X 1 X 2 • v 2 • A decomposição de valor singular (SVD) • da matriz estequiométrica (S) dessa reação • é obtida como a seguir: 127

• Continuação • X 1 X 2 • v 1 v 2 -1 1 = 2 -1/2 -1 1 2 0 2 -1/2 1 -1 1 1 0 0 1 1 S = U ∙ ∑ VT A 2 a. coluna de U compreende o espaço-nulo esquerdo de S. A 2 a. fila de VT compreende o espaço-nulo (direito) de S. 128

• Computação dos valores singulares • Seja a matriz estequiométrica S 3 x 6 corres • pondente à rede metabólica anterior: • v 1 v 2 v 3 v 4 b 1 b 2 • X 1 -1 -1 0 0 -1 0 • S = X 2 1 0 1 -1 0 -1 • X 3 0 1 -1 1 0 0 • A SVD de S pode ser obtida pelo uso do matrix-calculator acessado em //www. bluebit. gr/matrix-calculator/ calculate. asp (resultado a seguir) 129

• • Decomposição SVD: U= • • • -0. 082 0. 858 0. 508 0. 000 0. 802 -0. 245 0. 544 0. 000 -0. 591 -0. 452 0. 068 0. 000 • ∑= • • • 2. 361 0. 000 • V= 0. 375 -0. 216 0. 590 -0. 590 0. 035 -0. 340 0. 000 1. 953 0. 000 0. 782 0. 000 -0. 565 0. 047 -0. 671 0. 205 0. 106 -0. 159 -0. 106 0. 159 -0. 439 -0. 649 0. 126 - 0. 696 0. 000 0, 000 0. 000 -0. 734 0. 000 0. 419 0. 363 -0. 392 0. 210 0. 700 0. 285 -0. 210 0. 337 0. 677 0. 314 - 0. 363 0. 392 -0. 314 0. 363 -0. 392 • 130

• • MODOS ELEMENTARES DE FLUXO 131

• Modo de fluxo: • distribuição de fluxos estacionários • que mantêm proporções fixas. • 1 • v 1 • 2 3 • v 2 • v 1 / v 2 = constante 132

• • Formalmente, o modo de fluxo, M, é definido com o conjunto M = {V Є Rr: V = λ V*, λ >0} , satisfazendo às condições: estado estacionário, SV* =0; para reações irreversíveis, tem-se que um subvetor de V, V*irr >=0. 133

• • Modo elementar de fluxo: um modo de fluxo indecomponível; compreende um conjunto mínimo de reações enzimáticas irreversíveis • e em regime estacionário; • o conjunto de modos elementares • E é único para uma dada rede meta • bólica. 134

• • Por computação dos modos elementares de fluxo (E), uma rede metabólica pode ser decomposta em partes mínimas, sob a condição de estado estacionário. Os aspectos essenciais da estrutura da rede podem tornar-se aparentes. 135

• • • Combinação linear de fluxos: uma distribuição de fluxos pode ser representada por uma combinação linear de fluxos elementares: V = λ 1 e 1 + λ 2 e 2 +. . . = ∑i λiei λi ≥ 0 136

• ANÁLISE DE ROTAS • METABÓLICAS POR MODOS • ELEMENTARES DE FLUXO • Schuster, S. , Fell, D. , Dandekar, T. : • A general definition of metabolic pathways • useful for systematic organization and analysis of complex metabolic networks. Nature Biotechnol. 18(2000) 326 -332. 137

• O programa usado para computar • modos elementares de fluxo E • em redes metabólicas: • YANA • 2003 -2004 Dep Bioinformatics, Univ. of • Würzburg • //yana. bioapps. biozentrum. uni-wuerzburg. de 138

• O algorítmo sobre o qual YANA é • baseado não será detalhado aqui. • Pode ser achado em • //www. mpi-magdeburg. mpg. de/de/research/projects/ • 1010/1014/1020/mfaeng/mfapric. html • //www. biomedcentral. com/1471 -2105/6/135 139

• Como ilustração, pode ser executado o • exemplo (contido na distrbuição do YANA) que permite computar os modos elementares de fluxo para a rota das fosfopentoses (arquivo glycolysis+ppp. sbm). • A matriz estequiométrica da sub-rede con • siderada é computada de início. • Dados de entrada e saída são listados e gra • ficados. • 140

• • ANÁLISE DE BALANÇO DE FLUXOS EM REDES METABÓLICAS. PROGRAMA DE COMPUTADOR FBA versão 2. 0 por Jeremy S. Edwards e Bernhard Palsson 141

• • Capacidades do “software” FBA: Calcula distribuições ótimas de fluxo para função-objetivo definida pelo usuário. Permite estudar o efeito da supressão de genes. Gera mapa de fluxos. 142

• • • Um excelente “primer” de FBA (Nature Biotechnology) e uma versão de demonstração do programa podem ser obtidos de //gcrg. ucsd. edu/downloads/fba. html 143

• • Um programa interativo de demonstração (FBA/MOMA) para E. coli, computa fluxos metabólicos e possibilta prever efeitos resultantes da supressão de gene(s). Pode ser usado em: //atlas. med. harvard. edu/moma/ 144

• Leitura sugerida: • • • Palsson, B. O. Systems Biology. Properties of Reconstructed Networks. Cambridge University Press. 2006. Stephanopoulos, G. N. , Aristidou. A. A. , Nielsen, J. Metabolic Engineering. Academic Press. 1988. Meyer, C. D. Matrix analysis and applied linear algebra. SIAM. Philadelphia. 2003. • Boldrini, J. L. et al. Álgebra Linear. Harper & Row • do Brasil(editora Harbra Ltda. ). 3 a. ed. 1986. • Campbell, H. G. Matrices with Applications. Mere- • dith Corp. New York. 1968. 145