MEDIOS DE CULTIVO Y TCNICAS DE AISLAMIENTO Microbiologa

MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Microbiología Práctica 2014

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO GENERALIDADES Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una fuente de energía exógena y nutrientes esenciales tales como agua, carbón, nitrógeno, minerales y factores de crecimiento, además de las condiciones ambientales apropiadas como son p. H, temperatura, presión osmótica y oxígeno atmosférico.

Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los medios de cultivo los cuales pueden ser de muy variados tipos de acuerdo al microorganismo que se desee estudiar. Muchos materiales naturales como jugos, leche, vegetales y carnes pueden ser usados como bases para medios de cultivo.

El medio de cultivo puede ser líquido como los caldos, semisólido o sólido dependiendo de la consistencia que adquiere el medio líquido al agregar diferentes concentraciones de un solidificante como el agar, que es un extracto de algas marinas.

El agar no es utilizado como nutriente por la mayoría de las bacterias, así pues actúa solamente como solidificante. Se funde alrededor de 100° C y permanece líquido hasta que se enfría de 42° a 43°C. La gelatina se puede usar también pero con el inconveniente de que funde a 25°C y puede ser hidrolizada por muchas bacterias.

MEDIOS DE CULTIVO Substancias nutritivas que permiten el desarrollo de microorganismos en el laboratorio Cultivo: brindar condiciones óptimas de crecimiento Fáciles de preparar Baratos Permitir el desarrollo de gran variedad de gérmenes Aportar nutrientes adecuados (aminoacidos, nucleótidos, factores de crecimiento, glucosa, iones inorganicos)

MEDIOS DE CULTIVO Optimo contenido de H 2 O y correcto p. H Requerimientos de O 2 Estéril, evitar contaminaciones Incubación: temperatura óptima en estufas

MEDIOS DE CULTIVO QUÍMICAMENTE DEFINIDOS Es uno de los cuales se conoce la composición química exacta. Suelen reservarse para el trabajo experimental o para el crecimiento de bacterias autótrofas

MEDIOS COMPLEJOS Se cultivan de modo sistemático a las bacterias heterótrofas y los hongos en los medios de cultivo complejos Agar nutritivo Caldo nutritivo

MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS Hasta 1930 la preparación de medios de cultivo requería de mucho tiempo ya que se debía de partir de materiales crudos que se iban pesando individualmente y algunos se tenían que preparar como las infusiones y extractos por métodos muy tediosos. Sin embargo, ahora se cuenta con medios de cultivo deshidratado que han simplificado mucho el trabajo ya que solo hace falta leer las instrucciones en cada frasco, disolver la cantidad necesaria en agua, ajustar el p. H, dispensar en tubos y esterilizar.

DISOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Para disolver los medios de cultivo deshidratados se debe utilizar agua recién destilada o desmineralizada con un p. H lo más cercano posible a 7. 0. El recipiente que se utilice debe ser de preferencia un matraz Erlenmeyer con una capacidad mayor al volumen de medio que se va a preparar para que se pueda agitar fácilmente. Los medios que no contienen agar se pueden disolver fácilmente en agua fría o con un ligero calentamiento, sin embargo si el medio contiene agar o gelatina requerirá de calentamiento.

AJUSTE DEL PH Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad el p. H del medio usualmente quedará dentro de los límites adecuados, aún así es conveniente ajustar el p. H lo que se puede hacer con un potenciómetro o en su defecto con papel p. H 4. 0 -7. 0. Si el medio es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a 45°-50°C ( aún está liquido) y en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del p. H se efectúa con HCl o Na. OH 1 N o 0. 1 N tomando una muestra del medio de cultivo preparado y estéril, se mide el p. H y si fuera necesario se ajusta en la muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el total de medio.

ESTERILIZACIÓN Los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el caso de los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para vaciar una placa (aprox. 20 ml cada uno) o bien matraces para varias placas. Si en las instrucciones del medio no se indica otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave a 121 C por 15 minutos.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Naturales: solo usados para enriquecer medios (leche, suero, papa) Artificiales se preparan en el laboratorio � Líquidos: caldos � Sólidos: caldos adicionados de substancias capaces de solidificar (Agar-agar) Medios Complejos: extractos de carne, levadura, peptonas. Medios Enriquecidos: agregado de suero o sangre

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Medios selectivos: permiten crecer un solo tipo de microorganismo (substancias inhibidoras) Medios diferenciales o indicadores: evidencia alguna actividad metabólica por cambio de estado o color propia de un tipo determinado de microorganismo Medios de Transporte: traslado de muestras biológicas manteniendo las bacterias viables Medios de enriquecimiento: proporciona nutrientes y condiciones ambientales para favorecer el desarrollo de un microbio particular pero no el de otros.

MEDIOS DE CULTIVO COMUNES. Agar nutritivo: Es un medio de cultivo general, que sirve como base para la preparación de otros medios enriquecidos y selectivos.

Caldo nutritivo: se encuentra comercializado bajo diferentes denominaciones; según su formulación más o menos rica: caldo nutritivo, caldo infusión cerebrocorazón(BHI) caldo triptona de soja (TBS), caldo brucela, caldo columbia. Estos medios líquidos, con diversos grados de suplementos nutritivos, pueden utilizarse para cultivar bacterias o como base de otros medios líquidos o sólidos

TSB: medio de uso general. Se puede adicionar agar para obtener un medio sólido que, dispuestos en tubos inclinados, es de utilidad para el mantenimiento de microorganismos

MEDIOS ENRIQUECIDOS BHI: Infusión cerebro corazón, es un medio enriquecido y es un excelente caldo para hemocultivos. Caldo de tioglicolato: es el caldo de enriquecimiento más utilizado. Lleva agentes reductores que disminuyen el cociente de redox y favorece el desarrollo de anaerobios. La pequeña porción de agar que contiene evita que las corrientes de convección transporten el oxígeno atmosférico a toda la masa del caldo

MEDIOS ENRIQUECIDOS Agar sangre: se añade 5% de sangre de carnero a un agar base rico, como agar columbia, brucela, TSA, GC y otros. Cuando se pretende leer la hemólisis, se debe preparar el medio sin azúcares.

Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. .

El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc. ) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos

Agar Tripticasa de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido,

MEDIOS DIFERENCIALES Agar CLED: utilizado para el aislamiento y recuento de microorganismos en orina. La deficiendia en electrolitos logra inhibir la invasión o swarming del género Proteus. La lactosa permite diferenciar los microorganismos fermentadores por el viraje del indicador amarillo

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES Agar Mac Conkey: medio primario selectivo y diferencial que se emplea más a menudo para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores de gram positivos. Las bacterias que fermentan lactosa producen colonias color rojo y las no fermentadoras dan colonias incoloras mas o menos transparentes

Agar levine o eosina azul de metileno: es un medio selectivo y diferencial que se usa para el aislamiento, el cultivo y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos. Las colonias fermentadoras de lactosa presentan un tono violeta

Agar S-S: Es un medio diferencial selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonellas y Shigella. El desarrollo de otros bacilos gram negativos está inhibido por el verde brillante, sales biliares y las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato

Caldo de selenito: se utiliza para el enriquecimiento de Salmonella e inhibe a otras bacterias entéricas en las primeras horas de incubación.

Agar manitol salado o CHAPMAN: es un medio selectivo utilizado en el aislamiento de Staphylococcus, basado en la tolerancia que poseen a una alta concentración de Na. Cl 7, 5%. Sirve tamnién como medio diferencial de cepas fermentadoras de manitol. Staphylococcus aureus en condiciones anaerobias es la única especie del género que produce esta fermentación.

Agar thayer martin: tiene como base agar chocolate, suplementado por la adición de extracto de levadura y otros factores de enriquecimiento. También lleva antibióticos vancomicina, colimicina y nistatina que le confiere un carácter altamente selectivo. Permite el crecimiento de cepas exigentes de Neisseria.

MEDIOS ESPECIALES Agar Sabouraud: este medio se adapta particularmente al cultivo de la mayoría de las levaduras y hongos patógenos. Contiene una mínima cantidad de nutrientes y p. H ácido que lo hace selectivo.

Agar Lowenstein-Jensen: medio utilizado para el cultivo de Mycobacterium. También puede crecer Nocardia.

Agar mueller-hinton: Es un medio enriquecido, utilizado como medio de elección para realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

MEDIOS DE TRANSPORTE Agar stuart: es un medio especialmente creado para el transporte de muestras. Va dispuestos en tubos, en estado semisólido y con una profundidad adecuada. Actualmente es muy utilizado con los medios Aimes y Cary-Blair

METODOS DE SIEMBRA

INTRODUCCION Para poder estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone previamente de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas: Que no exista la cantidad suficiente del microorganismo que se busca. Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, parte ( los cuales son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. Generalmente los procesos infecciosos están creados por un agente causal sin embargo, es fácil que puedan proliferar en esas condiciones otros microorganismos oportunistas o incluso contaminantes. De ahí que una forma de evitar estos errores sea aislarlos inicialmente y posteriormente identificarlos.

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION Existen los siguientes materiales: Asas de siembra Hilos de platino Asas de Digrasky Hisopos Pipetas

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 1. ASAS DE SIEMBRA El asa de siembra es utilizada para la inoculación o siembra por estría en medios sólidos, por picadura en medios sólidos semisólidos y para la siembra de medios líquidos. Estas asas se llaman también de platino porque con este material se fabricaron por primera vez, aunque en la actualidad no se suelen utilizar. Éstas han sido sustituidas por asas de acero inoxidable o cromoníquel. Presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo diámetro es más o menos específico es decir, muchas de las asas son calibradas correspondiendo a un volúmen determinado de siembra. Las más utilizadas son las de 0, 01 mililitro que se esterilizan por flameado.

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 2. HILOS DE PLATINO Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semisólidos o sólidos.

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 3. ASAS DE DIGRASKY Son asas de vidrio con forma de triángulo más menos abierto. Se utilizan para extender el inoculo líquido previamente adicionado en la placa, por ejemplo, a través de pipeta Pasteur. Se esterilizan en estufa, en autoclave, aunque generalmente se puede hacer metiéndola en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 4. HISOPOS Se utilizan para la toma de muestras e incluso en muchos casos llevan un medio de transporte incorporado que permite transportar muestra sin que ésta sufra ninguna desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio cultivo. Se suele comercializar ya estéril, listo para utilizar y desechables.

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION 5. PIPETAS Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipetas tipo pera o prepipeta, pipetas Pasteur (no contienen volúmenes graduados), muy utilizadas en bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma que no tienen porqué ser necesariamente estériles, aunque sí la pipeta, también nos encontramos con micropipetas utilizadas para la siembra de mililitros y microlitros en un determinado medio de cultivo.

PREPARACIÓN DE INÓCULOS Un inoculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismo problema. � � Se debe partir de un cultivo puro y De una concentración adecuada de microorganismo problema. Si la muestra no es pura se aplicarán distintos métodos para el aislamiento mediante técnicas específicas: Siembra por estría en placa o por agotamiento, Emplear la técnica de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento más o menos separado de los microorganismos. � Utilizar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permiten el crecimiento del tipo de microorganismo concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro. � �

PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si el problema está en la cantidad de microorganismo, que no es suficiente, será necesario preparar un inoculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para obtener resultados fiables.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur estéril en cantidad suficiente y, en ambos casos, se homogeneizará posteriormente en el medio específico de cultivo. Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogeneizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para microorganismos patógenos coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesario la utilización de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior y de la cantidad de inoculo que se requiera.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido se utilizarán diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo; por ejemplo, siembra por agotamiento.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y se adiciona a un medio de cultivo líquido, se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura adecuada (unos 37 °C) en un tiempo aproximado de 24 horas. Es importante que los inoculos sean siempre jóvenes y en ocasiones excepcionales, sobre todo, si se necesita de mucha cantidad de inoculo, se podría utilizar rotavapor.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y ésta se añade al medio sólido, posteriormente se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose a la temperatura adecuada durante aproximadamente unas 24 horas. Se requerirán también cultivos jóvenes. Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o, incluso, caldo de cultivo base.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS A veces es necesario partir de un inoculo con un número aproximado de microorganismos problema. En estos casos, los inoculos se establecen en medios líquidos y el número de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de turbidez. Éste es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de los cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos

MÉTODOS DE INOCULACIÓN O SIEMBRA (MÉTODOS DE AISLAMIENTO) El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea líquido o sólido, se denomina siembra o inoculación. El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. Toda siembra, inoculación, o incluso resiembra, se puede realizar de diferentes formas según las características de la muestra, del medio en el que se van a sembrar o resembrar, del tipo de material que se utilice, etc. A continuación, se explican los métodos más importantes de siembra o inoculación.

SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO LÍQUIDO Si se realiza con asa de siembra, ésta se carga con la muestra problema sólida o a veces líquida en condiciones de esterilidad y se adiciona al medio líquido agitándola. Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo líquido agitándose hasta su homogeneízación. Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra.

SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO SOLIDO Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 1. Siembra del inoculo en placa Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. A. Técnica de Barry B. Asa de Digrasky C. Agotamiento por estría D. Técnica de los cuatro cuadrantes E. Técnica de los tres giros

TÉCNICA DE BARRY Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a 50 °C) en tubo, se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0, 1 a 0, 4 y se homogeniza la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar. La mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación del CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos.

ASA DE DIGRASKY Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digrasky Consiste en adicionar al medio sólido un inoculo que puede oscilar entre 0, 2 y 1 mililitro según los casos con pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se suele utilizar para el recuento de viables, antibiogramas, etc.

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRÍA Se tomará con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aquí se realizarán movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevo inoculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa.

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO Aislamiento en estría múltiple. Se tomará muestra problema con asa de siembra previamente estéril y dicho inoculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta, sólo en la parte superior. Flameamos el asa de platino y giramos ligeramente dicha placa repitiendo el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asa de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma dirección se repite la operación hasta un total de 4 o 5 veces, que son las que tienen cavida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de la misma.

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO Aislamiento en estría múltiple. El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez se va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo del asa de siembra.

TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Con un rotulador, por ejemplo, para vidrio, en la base de la placa (reverso) se dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal forma que ésta quede dividida en 4 cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de inoculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag. Realizaremos la misma operación sin flamear en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema, observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o separadas.

TÉCNICA DE LOS 3 GIROS. Se rotula la placa de forma análoga al caso anterior. Se toma inoculo con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90° y volveremos a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta completar toda la siembra (girando de nuevo la placa 90°). Esta técnica no es muy tilizada porque no permite buenos aislamientos.

TÉCNICA DE SIEMBRA POR DILUCIÓN Se dispondrá de una batería de tubo» con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra sólida o líquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que se añade en el tubo inicial. Se agitará hasta homogeneización. Con pipeta estéril se tomará una cantidad específica o exacta y se adicionará al segundo tubo, que se homogeneiza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada.

TÉCNICA DE SIEMBRA POR DILUCIÓN Con la dilución esperada, por ejemplo! 103 y 104, inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacto y extender con asa de Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.

SIEMBRA DEL INOCULO EN TUBO 1. Siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado. Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.

SIEMBRA DEL INOCULO EN TUBO 2. Siembra por picadura. Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de éste y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-Leiffson.

. SIEMBRA POR PICADURA Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de éste y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-Leiffson.

SIEMBRA DEL INOCULO EN TUBO 3. Siembra por picadura y estría. Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría; son ejemplos de este tipo de siembra la prueba en medio KIA y la prueba en medio citrato, entre otras.

METODO DE SIEMBRA EN PLACA POR ESTRIA CULTIVOS PUROS Se esteriliza el asa y luego se extrae con ella un inóculo del tubo. Se hace estrias en la placa extendiendo los microorganismos. El asa se vuelve a esterilizar entre distintas operaciones.