MEDII DE CULTURA CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP 4

• Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop: Ø izolarea bacteriilor din prelevatele patologice Ø identificarea bacteriilor Ø testari pentru initierea si monitorizarea terapiei antimicrobiene.

• Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ, microbiologul trebuie sa hotarasca: Ø mediile de cultura si metodele indicate pentru izolare Ø atmosfera, temperatura si intervalul de timp, necesare pentru izolarea tuturor microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat

Ø izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora Ø daca antibiograma este indicata si care din rezultatele ei se impun communicate.

• Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor. • Ele se comercializeaza ca atare, sub forma liofilizata, gelificata sau gata turnate in placi Petri sau pot fi manufacturate in multe laboratoare. • Ingredientul de baza al mediilor de cultura este geloza sau agar – agar.

• agar-agarul (numit și geloză) este un produs organic, hidro - coloidal ce se întâlnește într-o serie de alge marine – alge rosii (agarofite), din care este extras cu ajutorul apei fierbinți. • se prezintă sub formă de fâșii semitransparente de culoare cafeniegălbuie.

• conține: 70– 80% polizaharide, 10– 20% apă și 1, 5– 4% substanțe minerale. • este format din resturi galactozidice esterificate la C 6 cu o grupare sulfonică. • are o putere de gelificare foarte mare.

• Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultura pentru ca asigura suprafata solida pe care cresc bacteriile si fungii. • Cresterea bacteriilor nu distruge structura gelului deoarece cele mai multe bacterii sunt incapabile sa utilizeze agarul pentru metabolism.

• Agarul este comercializat sub forma de pulbere, care in amestec cu apa si incalzit la 100 °C ramane lichid, iar pe masura ce se raceste la 40 °C se gelifica. • Mediul cu agar este un mediu relativ inert. • Alte ingrediente, nutrienti, factori de crestere, indicatori de p. H sunt adaugati in mediul cu agaroza.

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE • Din punct de vedere a starii de agregare: Ø medii lichide Ø medii solide Ø medii semisolide

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE • Medii lichide – bulioane Au utilizare restransa: Ø izolarea din prelevate necontaminate (ex. sange, exsudate din seroase, aspiratii din colectii purulente profunde, biopsii tisulare prin ac

MEDII DE CULTURA Medii lichide • Izolarea in medii lichide: Avantaje: Ø cea mai sensibila metoda de izolare in vitro (cultura poate fi initiata de un numar redus de bacterii, volumul prelevatului insamantat poate fi crescut) Ø neutralizeaza prin dilutie factori antimicrobieni din prelevatul examinat

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE Mediile solide pot fi: Ø neselective Ø diferentiale Ø selective

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE • Medii neselective: Ø agarul imbogatit cu 5% sange de berbec – mediul neselectiv cel mai folosit pentru insamantarea prelevatelor necontaminate si a unora din cele contaminate Ex. : - exsudate din caile respiratorii si din cavitatile conecte - exsudat conjunctival - puroi

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE • Medii diferentiale – contin substratul pentru o anumita enzima sau citotoxina bacteriana si un indicator de p. H Ex. : - geloza – sange: diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice - medii lactozate, cu variati indicatori de p. H, diferentiaza enterobacteriile care fermenteaza lactoza (lactozo – pozitive) de cele care nu fermenteaza lactoza (lactozo – negative)

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE • Medii selective – contin substante care inhiba dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor. • Exista o diversitate de medii selective.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE • Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii cu trei niveluri de selectivitate: Ø slab selective: - mediul Mac Conkey (agenti inhibitori: saruri biliare si cristal violet) - mediul EMB (Levin) (agenti inhibitori: eozina Y si albastru de metilen) Inhiba bacteriile Gram (+).

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE Ø moderat selective: - mediul Salmonella – Shigella - mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza) - mediul Hektoen - mediul XLD - mediul Istrati – Meitert Agenti inhibitori: saruri biliare si verde briliant Inhiba bacteriile Gram (+) si o parte din bacilii Gram (-) comensali.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE Ø medii inalt selective: - mediu Wilson – Blair Agent inhibitor: verde briliant Inhiba o gama larga de bacterii pentru a facilita izolarea salmonelelor.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE • Agarul – sange poate fi facut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi nutritiv prin adaos de antibiotice: Ø colimicina si acidul nalidixic: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (–) si favorizeaza dezvoltarea celor Gram (+) Ø bacitracina: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (+) si favorizeaza izolarea hemofililor Ø kanamicina si vancomicina: favorizeaza izolarea bacililor Gram (-) anaerobi Ø etc.

MEDII DE CULTURA • MEDII DE IMBOGATIRE: - medii lichide, care prin anumite substante inhibitoare prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, fara a intarzia insa intrarea anumitor patogeni in faza exponentiala. Ex. : bulion cu selenit acid de Na. : preincubarea materiilor fecale 18 h. la 37°C in acest mediu, favorizeaza izolarea salmonelelor.

INCUBAREA CULTURILOR - temperatura: 37°C – majoritatea bacteriilor 20 - 30°C – unele bacterii (Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes) 42°C – altele: Campylobacter jejuni / coli Se foloseste pentru incubare termostatul.

INCUBAREA CULTURILOR • Atmosfera: Ø in prezenta O 2 – bacterii aerobe si facultativ anaerobe Ø in mediu cu 5 – 10 % CO 2 – bacterii carboxifile Ø in mediu cu O 2 (5 – 7 %), CO 2 (8 – 10%), N 2 (85%) – bacterii microaerofile

INCUBAREA CULTURILOR Ø in mediu anaerob: Procedee chimice: bulioane cu ingrediente reducatoare (acid thioglicolic sau thioglicolat de Na. tehnica OTT: incinta etansa in care O 2 este indepartat prin reactia cu pirogalolul in mediu alcalin. Procedee biologice: procedeul Tarozzi: utilizeaza tuburi cu bulion nutritiv in care agent reducator sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat, rinichi)

CARACTERE DE CULTURA • • • Exigente de cultivare Intervalul necesar pentru obtinerea culturii Aspectul si consistenta coloniilor Modificari ale mediului Mirosul degajat de cultura Aceste caractere orienteaza identificarea izolatelor!

CARACTERE DE CULTURA Exigente de cultivare • Bacterii nepretentioase • Bacterii cu anumite exigente nutritive: - Strict aerobe Strict anaerobe Facultativ anaerobe Microaerofile Carboxifile

CARACTERE DE CULTURA Intervalul necesar pentru aparitia culturii • Microorganisme cu crestere rapida: cultura apare dupa 18 – 24 h. (frecvent peste noapte) • Microorganisme cu crestere lenta: necesita zile sau saptamani pentru aparitia culturii

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor 1. Dimensiune: mm. Ø colonii mici (Ø < 1 mm. ) Ø colonii mijlocii (Ø ~ 1 mm. ) Ø microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul) Ø colonii mari (Ø > 2 mm. ) 2. Forma: Ø punctiforme Ø circulare Ø neregulate (“in harta geografica”) Ø filamentoase Ø dendritice Ø lenticulare

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor 3. Relieful: Ø plane Ø aplatizate Ø convexe Ø bombate Ø acuminate Ø pulvinate Ø ombilicate

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor 4. Marginile: Ø intregi Ø ondulate Ø lobate Ø zimtate Ø filamentoase Ø cu valuri succesive de invadare a mediului

CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor • Neteda, umeda, lucioasa – forma de cultura S – conditionata de hidrofilia si incarcatura electronegativa a structurilor microbiene de invelis • Mata, uscata, rugoasa – forma de cultura R a microorganismelor cu hidrofilie si incarcatura electronegativa reduse

CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor • Alte aspecte: - suprafata papilata - cu striuri radiare - zbarcita - catifelata - pufoasa - lanoasa - prafoasa

CARACTERE DE CULTURA Densitatea optica Colonii: • transparente • semitransparente • opace

CARACTERE DE CULTURA • Irizatii ale suprafetei unor colonii: pot fi surprinse anumite unghiuri de iluminare • Culoarea coloniilor: - alba galbena aurie neagra, in functie de varietatea pigmentilor produsi sau a virajului de culoare a unor indicatori introdusi in mediu.

CARACTERE DE CULTURA • Modificari ale mediului din jurul coloniilor: pot fi produse de citotoxine, enzime sau pigmenti difuzibili. Ø Hemoliza pe agar – sange Ø Reactii pe medii diferentiale zaharate Ø Reactii pe mediul cu galbenus de ou Ø Pigmentogeneza

CARACTERE DE CULTURA Hemoliza pe agar - sange • alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza hemolizei partiale • beta: zona complet clara, incolora, din cauza hemolizei complete • alfa – prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire, imediat inconjurat cu o zona de hemoliza clara, completa • gamma: absenta hemolizei • cald – rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta dupa incubare la 37°C) inconjurata cu o zona de hemoliza mai putin clara, dar fara modificare de culoare a mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la frigider)

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii diferentiale zaharate • Virajul de culoare a mediului • Culoarea coloniilor in functie de indicatorii de p. H • Fermentarea / Nefermentarea substratului

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii cu galbenus de ou • Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor • Lipaza: film circular cu irizatie perlata in imediata vecinatate a coloniilor • Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor

CARACTERE DE CULTURA Pigmentogeneza • Pigmenti hidrosolubili difuzeaza si coloreaza progresiv mediul: - fluoresceina - piocianina - melanina

CARACTERE DE CULTURA Mirosul degajat de cultura • Pseudomonas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie • Proteus: socolata arsa • Clostridii: putri, fecaloid, de corn ars • Prevotella melaninogenica: acru • Nocardiile si streptomicetele: de subsol mucegait

CARACTERE DE CULTURA Consistenta coloniilor • • untoasa mucoasa – filanta “albusului de ou bine batut spuma” friabila cretoasa pasloasa pieloasa

CARACTERE DE CULTURA Aderenta la mediu • neaderente (antrenate de ansa aluneca pe suprafata mediului) • putin aderente • incastrate in mediu