MEDICINSKO BIOKEMIJSKA LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ODREIVANJA KONCENTRACIJE UKUPNIH PROTEINA

MEDICINSKO BIOKEMIJSKA LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ODREĐIVANJA KONCENTRACIJE UKUPNIH PROTEINA U SERUMU BIURET METODOM MARIJAN MATEJČIĆ

PONAVLJANJE • Pri pipetiranju reagensa ćemo koristiti automatsku makropipetu sa varijabilnim (podesivim) volumenom pipetiranja najčešćeg raspona (1000 – 5000 µl) a pri pipetiranju slijepe probe, standarda i uzorka koristiti ćemo se automatskom mikropipetom varijabilnog volumena (najčešćeg raspona 10 -100 µl). Ukoliko imate pipete fiksnog volumena ili dio pipetiranja radite npr. pipetiranje reagensa izvodite pipetiranjem sa staklenom pipetom i propipetom onda radite onako kako vam je pokazao i kako vas je naučio vaš predmetni nastavnik. Pipete valjda držati uspravno, u razini sa očima, da vidite što se točno dešava i da u potpunosti kontrolirate postupak pipetiranja.

• Ako smatrate da ste nešto krivo pipetirali, odbacite nastavak sa uzorkom, stavite novi nastavak i pažljivo ponovite pipetiranje. Nastavke koje koristimo sa automatskim pipetama su plastični i za jednokratnu su upotrebu. Svaki nastavak treba pogledati prije pipetiranja jer je moguće da je u proizvodnom procesu došlo do greške pa pojedini nastavci odstupaju izgledom, oblikom i na kraju kvalitetom. U izvanrednim se situacijama može oprati i osušiti nastavke te ih ponovno koristiti.

• Svaki nastavak pri montiranju na pipetu pažljivo uhvatite samo za njegov gornji dio (koji najčešće ima okomito postavljene crte radi lakšeg montiranja) koji ne ide u spremnik sa (reagensom, standardom, uzorkom – da ne bi sa puderom od rukavica, ili nečim drugim kontaminirali – zagadili spremnik) te nakon stavljanja lagano zarotirajte nastavak da se uvjerite da čvrsto priliježe na pipetu. Nakon montiranja nastavka provjerite na koji je volumen namještena pipeta, isprobajte prvi korak i prvi korak sa drugim korakom. Najčešće radimo u duplikatu ili triplikatu uzorka uz monoplikat ili duplikat standarda što znači da nam treba 3 -5 epruveta za svakog učenika ovisno o odluci nastavnika.

KOMPETENCIJE KOJE STJEČEMO • Glavni ciljevi vježbi jesu razvijati motoriku držanja pipeta, stavljanja i skidanja nastavaka, točnog pipetiranja prvog i prvog s drugim korakom, miješanje reakcijske smjese, i dobivanje kvalitetnih Apsorbancija koje će preračunavanjem u koncentracije određivanog analita u uzorku svaki puta pokazivati veću točnost, preciznost i reproducibilnost kod učenika.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA UKUPNIH PROTEINA U SERUMU – BIURET METODA PRINCIP METODE • U Biuret reakciji dvovalentni ioni Bakra u slabo alkalnoj sredini vežu se na dušikove atome aminokiselina proteina tvoreći plavo ljubičasti kompleks čiji je intenzitet proporcionalan koncentraciji proteina u uzorku (Lamber- Beer-ov zakon). Pozitivnu reakciju daju proteini i polipeptidi, dok aminokiseline, amonijak i dipeptidi ne reagiraju. Apsorbancije očitavamo na spektrofotometru.

UVJETI ODREĐIVANJA

POSTUPAK • Svaki učenik uzima svoj stalak za epruvete, stavlja lateks rukavice, provjerava je li mu zakopčana kuta, te u svaku pipetira 1000 µl reagensa i 20 µl standarda i uzorka a slijepu probu (pipetira nastavnik). Pipetiramo tako da uzmemo pipetu, pravilno namjestimo nastavak, provjerimo namješteni volumen na pipeti, stisnemo prvi korak na pipeti za probu pa onda držeći prvi korak uđemo u spremnik sa reagensom i polako otpustimo palac čime je u nastavak ušlo 1000 µl reagensa. Prenesemo reagens u kemijski čistu epruvetu te stisnemo prvi i nakon prvog i drugi korak da izbacimo sav uzorak u epruvetu. Promijenmo nastavak i to ponovimo stavljajući jednaku količinu reagensa u sve epruvete.

• Nakon toga u dvije pipetiramo 20 µl standarda (uzorka poznate koncentracije) na potpuno isti način s bitnom razlikom da kad ulazimo u epruvetu s nastavkom gotovo do površine reagensa, stisnemo prvi i drugi korak 2 -3 puta da bi bili sigurni da smo ispipetirali sav sadržaj iz nastavka, nakon čega odbacujemo nastavak, epruvetu promiješamo da bi se reakcijska smjesa homogenizirala i nastavimo sa pipetiranjem ostalih uzoraka. Istovremeno pogledamo na sat da zapamtimo kada je krenula reakcija u prvoj epruveti da bi znali kada je završila inkubacija uzoraka.

• Epruvete obilježimo ili složiti po sebi specifičnom rasporedu da kasnije ne zamijenimo uzorke i napravimo grubu predanalitičku grešku. Nastavnik priprema spektrofotometar za rad, provjerava valnu duljinu sa slijepom probom te sa učenicima očitava dobivene Apsorbancije a nakon čega svaki učenik za sebe računa aritmetičke sredine, izbacuje eventualno jedan od rezultata iz triplikata te izračunava i iznosi koncentraciju uzorka dobivenu njegovim radom. Nakon svake vježbe ostaju dva redara koja peru epruvete i stavljaju ih na sušenje te dezinficiraju radne površine na kojima smo radili.

• Komentar rezultata - (točnost, preciznost i reproducibilnost):

PONAVLJANJE 1. U Biuret reakciji se s proteinima i polipeptidima vežu ioni kojeg elementa? 2. Prema kojem zakonu je koncentracija proteina u uzorku proporcionalna intenzitetu obojenosti? 3. Nabroji tri najbitnije odlike kvalitetnog rada u laboratoriju te dobivanja kvalitetnih i pouzdanih nalaza. 4. Je li korištenje jednokratnih plastičnih nastavaka ekološki osviješteno ponašanje i koje bi mogle biti supstitucije i alternative u budućnosti, promislite i napišite ideje.