Mechanismus der VDJ Rekombination Signale auf DNA Ebene

Mechanismus der V(D)J Rekombination Signale auf DNA Ebene: RSS Rekombinasekomplex Spaltung und Verknüpfung der Segmente

V(D)J Rekombination Deletion und Inversion

Erkennungssequenzen auf DNA Ebene RSS: „recognition signal sequences“ 1 -turn Signal: Heptamer-12 -Nonamer 2 -turn Signal: Heptamer-23 -Nonamer Rekombination nur zwischen 1 -turn Signal und einem 2 -turn Signal möglich

Anordnung der RSS für einen Lokus identisch, bei verschiedenen Loci unterschiedlich weiss: 1 -turn schwarz: 2 -turn

Verknüpfung der Signalenden: präzise Verknüpfung der kodierenden Segmente: „unpräzise“

Einzelschritte der V(D)J Rekombination: Zusammenführung der Signale Spaltung und Bildung der Haarnadelschleife Öffnen der Haarnadelschleife und Endbearbeitung Reparatur und Ligation

Synapsis: kombiniertes Schneiden, Zusammenführen der Enden in Komplex, der alle 4 Enden bindet

V(D)J Rekombinase: RAG 1 und RAG 2 (recombination activation genes) einzige lymphoid-spezifische Faktoren für Rekombination andere Faktoren in allen Zellen vorhanden k. o. Mäuse: keine reifen T und B Zellen, keine anderen Defekte RAG 1 + RAG 2 binden RSS und spalten DNA zwischen Heptamer und kodierendem Segment 2 Stufen: Nick am 5´-Ende des Heptamers Hairpin Bildung Mg 2+ HMG 1 und 2 erhöhen Effizienz der Spaltung am 2 -turn RSS und bevorzugte 1 -turn + 2 -turn Paarung

Spätere Stadien der Rekombination: Spalten des Hairpin und Verknüpfung der Enden DNA Doppelstrangbruch-Reparaturenzyme: DNA-PK Artemis Ku Proteine DNA Ligase IV XRCC 4 Histon H 2 AX Mre 11/Rad 50/Nbs 1 Komplex

Öffnen des Hairpin: DNA-PK phosphoryliert und aktiviert Artemis, Endonuklease, welche Hairpin spaltet

„Junctional Diversity“

„Coding joints“ Nukleotide gehen verloren, kommen neu dazu (ohne Template) P-Nukleotide: „hairpin“ N-Nukleotide: Td. T (terminal deoxynucleotidyl transferase) bis zu 15 N Exonuklease

Artemis: bei Defekt humane SCID Form DNA-PK bindet und aktiviert Artemis durch Phosphorylierung, Artemis bekommt dadurch Endonuklease-Aktivität für Hairpin und 5´- und 3´-überhängende Einzelstrang-DNA DNA-PK besteht aus Katalyt. DNA-PKs Untereinheit und Ku Protein-Heterodimer (Ku 70 und Ku 80) Ku bindet DNA, überbrückt Enden DNA Ligase IV / XRCC 4 Komplex auch wichtig, da defekte Zellen bestrahlungssensitiv sind, und keine signal- oder coding joints machen können weiters vermutlich beteiligt: Histon H 2 AX Mre 11/Rad 50/Nbs 1 Komplex: DNA repair in Hefe fördert Verknüpfung von DNA an Mikrohomologien ?