Mara Espino Hernndez Lic MSc Escuela Latinoamericana de

María Espino Hernández, Lic. , MSc. Escuela Latinoamericana de Medicina E-mail: mespino@elacm. sld. cu

Determinación de la susceptibilidad in vitro Importante función del Laboratorio de Microbiología Clínica Monitorear niveles de resistencia Instauración de políticas terapéuticas

¿Era post. Antibiotica?

Muy pocos fármacos dirigidos al tratamiento de bacterias multirresistentes Pseudomonas aeruginosa Enterobacterias productoras de BLEE Estafilococos meticilino resistentes

q El desarrollo de nuevas drogas puede durar varios años. q Se necesita preservar la utilidad de los antimicrobianos disponibles a través de un uso óptimo y acertado. q Las combinaciones de antimicrobianos son comúnmente utilizadas en la práctica clínica q No obstante, el riesgo de provocar un efecto contrario al deseado, incrementar la toxicidad y los costos del tratamiento, no es poco frecuente.

Actividad Combinada de Antimicrobianos Objetivo: Lograr un efecto terapéutico más rápido e incrementado Técnica del Tablero Técnica de Curva de Muerte Métodos de Difusión E-test

q GENERAL Contribuir al conocimiento de la etiología y susceptibilidad de los agentes causales de la sepsis neonatal y a la aplicación adecuada del tratamiento antimicrobiano. q ESPECÍFICOS ü Caracterizar el comportamiento y la etiología de la sepsis neonatal durante el periodo de estudio. ü Describir el comportamiento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos utilizados. ü Identificar los patrones de resistencia de las cepas aisladas a los ß-lactámicos y aminoglucósidos.

ü Evaluar los resultados del sinergismo in vitro e in vivo, entre las combinaciones de ß-lactámicos y aminoglucósidos aplicadas como tratamiento a los pacientes, tomando en cuenta el patrón de susceptibilidad de las cepas. ü Evaluar la eficacia del “tablero de damas” como procedimiento para orientar el tratamiento antimicrobiano combinado.

Tipo de estudio q Investigación analítica prospectiva y estudio retrospectivo longitudinal de tendencias. Marco de la investigación q Hospital Docente Ginecobstétrico “América Arias”, Enero 1993 - diciembre 2000. Universo q 534 pacientes con sepsis y 1 457 cepas aisladas de hemocultivo. Muestra q 163 pacientes (selección por expertos) y 533 aislamientos bacterianos.

Algoritmo clínico-microbiológico para evaluar la eficacia del tratamiento antimicrobiano combinado PACIENTE CON RECIEN NACIDO SIGNOS CLÍNICOS DE SEPSIS SEPTICO Aislamiento e identificación HEMOCULTIVO 1 ra. Resiembra 16 -20 horas incubación REEVALUACIÓN DE LA TERAPÉUTICA 48 -72 horas APLICAR TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO SEGÚN PROGRAMA DE POLÍTICA Prueba de susceptibilidad y Sinergismo

SUSCEPTIBILIDAD Y SINERGISMO ANTIMICROBIANO (NCCLS, 1993; CLSI, 2006) CMI (µg/m. L) 35 o. C 24 h. 0, 125 -128 0, 5 Mc. Farland, Dil. 1: 31 Microdilución en CMH-CA, Antimicrobianos: 0, 5 Mc. Farland, Dil. 1: 31 35 o. C, 24 h. Sinergismo Cálculo de CFI. 0, 06 -64 µg/m. L Multirresistencia (CDC, 2006): - Estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a vancomicina - Enterobacterias resistentes a todos los ß-lactámicos o todos los aminoglucósidos. - BNF resistentes a penicilinas de amplio espectro. Amikacina Ampicilina Azlocilina Cefazolina Cefotaxima Ceftriaxona Gentamicina Kanamicina Oxacilina Penicilina G Vancomicina

Tablero de Damas (Checkerboard) Antibiótico 2 (A 2) (µg/m. L) Antibiótico 1 (A 1) (µg/m. L) Índice de Concentración Fraccionaria Inhibitoria (CFI) (Berenbaum, 1978) CFI = CMI A 1/A 2 CMI A 2/A 1 + CMI A 1 solo CMI A 2 solo Criterios de interpretación (Berenbaum, 1978; Eliopoulos, 1989) - Sinergismo (S): CFI 0, 5 - Sinergismo parcial o bajo (SP): 0, 5 < CFI < 1 - Indiferencia o adición (I): 1 CFI < 2 - Antagonismo (A): CFI 2

Figura 1. Agentes causales de sepsis neonatal. Hospital “América Arias”, 1993 -2000. Total: 533 aislamientos. Leyenda: (a): Estafilococo coagulasa negativa; (b): Bacilos gramnegativos no fermentadores; (c): Estreptococo ß-hemolítico - (Shimabuku et al. , 2004; Schrag y Schuchat, 2005; Alonso et al. , 2005; Härtel et al. , 2008)

Resistencia bacteriana. Hospital “América Arias”, 1993 -2000 Tendencia: Incrementos significativos: ß-lactámicos (p 0, 001) y amikacina (p 0, 05) Patrones de resistencia principales (grampositivos): ß-lactámicos: Aminoglucósidos: SARM (33, 9%) K-G: (51, 4 y 48, 7%) ECNRM (64, 8%) K-G-AK: (27, 0 y 25, 3%) - Enterococcus faecium (Van. A) vancomicina-teicoplanina resistente (CMI 128 µg/m. L) - Cuatro aislamientos ECNRM-vancomicina resistente (CMI 128 µg/m. L)

Patrones de resistencia principales (gramnegativos): Enterobacterias: ß-lactámicos: Aminoglucósidos : AM-AZ (32, 2%) K-G: (20, 7%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (33, 3%) K-G-AK: (28, 7%) BNF: ß-lactámicos: Aminoglucósidos : AM-KZ-CTX-CRO (31, 9%) K-G: (23, 6%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (40, 3%) K-G-AK: (29, 2%)

Hospital Docente Ginecobstétrico “América Arias”. Enero 1993 -diciembre 2000. Combinaciones ensayadas y pacientes evaluados: 163 Penicilina G/kanamicina Penicilina G/gentamicina Penicilina G/amikacina Azlocilina/amikacina Cefazolina/amikacina Cefotaxima/amikacina Ceftriaxona/amikacina Meticilina/gentamicina Meticilina/amikacina Meticilina/kanamicina Resultados in vitro de la interacción entre los fármacos probados Sinérgicas: 56 Parcialmente sinérgicas: 25 Indiferentes: 71 Antagónicas: 10

Resultados del sinergismo in vitro. Tabla 1. Valores de Concentración fraccionaria inhibitoria y Concentración mínima inhibitoria en las combinaciones ensayadas Disminución de CMI (µg/m. L) Interacción Índice CFI (Media geométrica) ß-lactámico Aminoglucósido Sinérgico 0, 276 1/8 1/32 Sinérgico parcial 0, 664 1/2 1/4 Indiferente 1, 097 0 1/128 Antagónico 2 0 0

Tabla 2. Relación entre el sinergismo in vitro y la eficacia clínica del tratamiento Eficacia clínica del tratamiento (b) Interacción in vitro (a) Eficaz No eficaz Total Sinérgico 51 5 56 Sinérgico parcial 18 7 25 Indiferente 52 20 72 Antagónico 0 10 10 121 42 163 Total p (a-b) 0, 001 (3 gl); 2 = 37, 32

Tabla 3. Relación entre el sinergismo in vitro y la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinación ensayada Patrón de susceptibilidad de la cepa a los fármacos combinados (b) Interacción in vitro (a) Sensible a uno de los dos Resistente a los dos Total Sinérgico 31 25 56 Sinérgico parcial 11 14 25 Indiferente 35 37 72 Antagónico 0 10 10 Total 77 86 163 p (a-b)=0, 014 (3 gl); 2 = 10, 59

Patrones de 34 cepas bacterianas multirresistentes con las que se obtuvo sinergismo in vitro Leyenda: P= penicilina; OX= oxacilina; KZ= cefazolina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; K= kanamicina; G= gentamicina; AK= amikacina; AM= ampicilina; AZ= azlocilina.

Tabla 4. Patrones de resistencia de 10 cepas con las que se obtuvo antagonismo in vitro No Patrón Agente Causal Total 1 AM-K-G Enterobacter 1 2 AM-AZ-K E. coli 1 3 AM-AZ- K-G BNF 1 4 AM-AZ-KZ-K E. coli 1 5 AM-AZ-KZ-K-G-AK Enterobacter 1 6 AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G Enterobacter 1 7 P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G ECN 2 8 AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AK BNF 2 Leyenda: AM= ampicilina; K= kanamicina; G= gentamicina; AZ= azlocilina; KZ= cefazolina; AK= amikacina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; P= penicilina; OX= oxacilina

Tabla 5. Relación entre la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinación probada y la eficacia clínica del tratamiento Susceptibilidad de la cepa a los fármacos combinados (a) Eficacia clínica del tratamiento (b) Eficaz No eficaz Total Sensible a uno de los dos 62 15 77 Resistente a los dos 59 27 86 Total 121 42 163 P (a-b)=0, 119 (1 gl); 2 = 2, 42

Tabla 6. Eficacia del Tablero de Damas como procedimiento diagnóstico. q Verdaderos positivos (VP)= 37; Falsos positivos= 70; Verdaderos negativos (VN)= 51; Falsos negativos (FN)= 5 Parámetro Valor (%) IC (95%) Sensibilidad 88, 10 86, 85 – 89, 35 Especificidad 42, 15 41, 68 – 42, 62 Valor predictivo positivo 34, 58 34, 06 – 35, 10 Valor predictivo negativo 91, 07 90, 13 – 92, 01 Razón de verosimilitud positiva 1, 52 Razón de verosimilitud negativa 0, 28

Método: “Tablero de Damas” Sensibilidad: 88, 10% Valor Predictivo Negativo: 91, 07% Paciente con sepsis grave por microorganismo multirresistente PRUEBA DE SCREENING VALIOSA

q El panorama epidemiológico de la sepsis neonatal se mantuvo estable durante el periodo analizado con una mayor incidencia de estafilococos en la sepsis precoz y la tardía. q La resistencia global a los antimicrobianos fue elevada, y se incrementó significativamente para cefalosporinas, gentamicina, amikacina y para oxacilina en cocos grampositivos. q Se encontró una amplia variedad de patrones de resistencia para ß-lactámicos en bacterias gramnegativas y fueron frecuentes los patrones kanamicina-gentamicina y kanamicina-gentamicina-amikacina en todas las cepas. q Las combinaciones de fármacos sinérgicas in vitro mostraron una elevada probabilidad de eficacia para el tratamiento, con independencia del patrón de susceptibilidad de la cepa y de si ésta fue o no resistente a los dos antibióticos combinados.

q La probabilidad de obtener eficacia clínica con la fusión de antimicrobianos con sinergismo parcial in vitro, fue la misma que se obtuvo con las combinaciones cuyo resultado fue indiferente y todos los resultados antagónicos in vitro se correspondieron con falla clínica del tratamiento in vivo, corroborando así, que el criterio asumido en este estudio fue adecuado. q El método del tablero de damas fue un buen procedimiento diagnóstico para predecir los tratamientos ineficaces y para advertir la probabilidad de una terapéutica eficaz cuando la prueba fue sinérgica.

“Tablero de Damas y Microdilución. Especificaciones Técnicas y Algoritmo de Trabajo para su aplicación en la práctica Clínico-Microbiológica” (Metodología para evaluar combinaciones de fármacos in vitro y su eficacia en el paciente) Autor: Prof. María Espino Hernández Asesores: Prof. Jorge L. Zuazo Silva Dra. Isabel Martínez Mota Escuela Latinoamericana de Medicina, 2008

Partes componentes: TABLA DE CONTENIDO RESUMEN INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES y OBJETIVOS SECCIONES (1 a la 5) BIBLIOGRAFÍA ANEXOS (Tablas, esquemas y Figuras)

SECCIONES 1 Selección y preparación de los antimicrobianos 2 Métodos 3 Procedimientos para el control de la calidad

4 5 Comentarios a los procedimientos de microdilución y el tablero de damas Algoritmo de trabajo microbiológico