Lucas Brando UFRPE QTOF Quadrople Time of Fligth
Lucas Brandão UFRPE Q-TOF Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqüenciamento de Proteínas
Espectrômetro de Massa
• Existem diversas plataformas para análise em espectrometria de massa – Várias configurações possíveis. • A primeira pergunta – Qual a diferença principal nos resultados entre os q-TOF para outras plataformas?
Conclusão • Q-TOF é muito mais sensível e com um poder de resolução muito maior • MAIOR – Sensibilidade – Resolução – acurácia
Quadropole-Time of Flight • Devido as vantagens do espectro de TOF ele é utilizado como analisador • Assim o quadropole pode ser usado como um filtro de massa que transmite apenas o íon parente (precursores) de interesse Q-TOF pode ser utlizado tanto no modo MS, quanto no modo MS/MS Todos os espectros de massas obtidos tanto no MS, quanto MS/MS mode, são gravados com um TDC (time-to-digital converter)
• Segunda pergunta: – O que pode influenciar no resultado final de um q. TOF? Ionização positiva Ionização negativa TCD (time-to-digital converter)
Perguntas que se deve fazer • Amostra: – como será processada? – Qual a procedência? • Ionização: – Positiva ou negativa? – ESI ou MALDI? MAIOR Sensibilidade Resolução acurácia
Tipos de dados • O principal tipo de dado que espectrômetro de massas produz é um – Espectro de massa Cromatograma de massa • selected ion monitoring (SIM), • total ion current (TIC), • selected reaction monitoring chromatogram (SRM) um
Espectro de Massa MS Intensidade m/z
Resolução de Massa Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia M 1 = 2, 0157 M 2 = 1, 9793
Resolução de Massa Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia Quanto mais estreito o pico, maior é a resolução e maior a precisão em determinar m/z Full width at half maximum
Resolução de Massa M 1 = 2, 0157 M 2 = 1, 9793 M 1 -M 2 = 0. 0364 Resolução = (286/0. 0364) = 7857
Comparação entre alta e baixa resolução BAIXA RESOLUÇÃO: Amostra com contaminantes mas apenas um único pico ALTA RESOLUÇÃO: Amostra com contaminante sendo mostrado com dois picos Baixa resolução: Um único pico
Seqüenciamento de Proteínas
Overview
Q-TOF Duas possibilidades Modo MS/MS
Resultados em MS mode • Produz um mapa peptídico (peptide map) ou PMF (peptide mass fingerprint) – A proteína foi tripsinizada e depois analisada pela MS, sem a necessidade de ocorrer a separação (filtro) de íons – Se a proteína já existe ele será encontrada no banco de dados.
Resultados em MS/MS mode • Caso da caracterização pelo peptide map, não seja suficiente para determinar a proteína, • Pode ser realizada a separação, fragmentação dos íons selecionados e em seguida ocorrer a analise pelo TOF.
Modo MS/MS • Para fazer esta analise é necessário realizar a seleção do íon precursor – Visto que o volume de dados impossibilita a aquisição de todos os íons num único espectro de massa – Tomar a decisão de qual íon precursor deve ser selecionado
Critérios • Intensidade • Status da carga • m/z Depois que ocorre a seleção do íon precursor, o modo MS/MS é automaticamente ligado Após um determinado período ou até que um certo critério seja preenchido o sistema retorna ao modo MS E permanece nesse modo (MS) até que outro íon precursor seja novamente selecionado
Seleção e fragmentação
Ou seja. . . • Uma corrida – Dura 70 mim – 350 espectros de massa (TOF) • Muitos picos: solventes, contaminantes e íons de peptídeos.
“De novo” seqüenciamento O Papel da câmera de colisão
Seqüenciamento de Proteínas • Para seqüenciar peptídeos é necessário realizar a sua fragmentação – Podem existir 3 tipos de quebras de ligações diferentes • NH-CH, CH-CO, e a ligação CO-NH – Cada fragmentação da origem a duas espécies • Uma neutra • E outra carregada
• A fragmentação acontece de maneira randômica e não seqüencial • Além disso, algumas fragmentações são “preferidas” em relação a outras – Por isso se encontra sinais de intensidades diferentes
Fragmentação peptídica e nomenclatura Íons • b = no amino terminal • y = no carboxil terminal A questão é que a fragmentação peptidica não acontece de forma sequencial
Íons b Íons y
Os íons b e y são utilizados para fazer o seqüenciamentos de um peptídeo.
OUTRO EXEMPLO
O Que fazer? 2 – olhar para o íon precursor: 1 - Olhar para os imunoíons menores: Provaveis a. a. Presentes no peptídeo.
lucabrand@gmail. com OBRIGADO PELA ATENÇÃO
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