Lkask mykologie Iva Kocmanov vod 1 Mykologie nauka

Lékařská mykologie Iva Kocmanová

Úvod 1. Mykologie – nauka o houbách (řec. mykes, lat. fungi) 2. Houby jsou organismy eukaryotní (pravé jádro, mitochondrie. . ), jednobuněčné i vícebuněčné, heterotrofní 3. Základní dělení: • houby mikroskopické (mikromycety) • houby makroskopické (těmi se zabývat nebudeme)

Osnova 1. Rozmnožování hub, názvosloví 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii (mikroskopie, kultivace, sérologie a molekulárně biologické metody) 5. Nejčastější mykózy (kandidóza, aspergilóza, kryptokokóza, fusarióza, zygomykóza, dermatomykóza……)

1. Rozmnožování hub pohlavní stadium (teleomorfa) a nepohlavní stadium (anamorfa) anamorfa + teleomorfa = holomorfa meióza (spory) mitóza (konidie) Penicillium repens (anamorfa) a Eurotium repens (telemorfa) - zdroj: www. myko. cz

1. Názvosloví hub Systematika hub je velmi složitá a stále ve vývoji (rozvoj genetických metod, anamorfa x telemorfa) V současné době existují 2 přístupy: Margulisová (houby s. l. do dvou říší) Cavalier-Smith (houby s. l. do tří říší)

1. Názvosloví hub • většina medicínsky významných hub se vyskytuje jako anamorfy (nepohlavní stadia) • pokud je teleomorfa (pohlavní stadium) známá, mělo by mít její pojmenování přednost – což se ovšem v klinické praxi obvykle neděje teleomorfa anamorfa Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria Aspergillus Eupenicillium, Talaromyces Penicillium Pseudoallescheria boydii Scedosporium apiospermum Issatchenkia orientalis Candida krusei

1. Názvosloví hub ALE – názory vědců se stále mění…. . V současné době se ustupuje od dělení na telemorfy a anamorfy a s tím se zase mění názvosloví – např: X Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria X teleomorfa Eupenicillium, Talaromyces X anamorfa Aspergillus X Penicillium aktivita „One Fungus = one name“

1. Názvosloví hub v klinické praxi…. A) Kvasinky a jim podobné • mikroskopicky kulaté nebo protáhlé buňky, 3 -6 x 3 -15 µm • nepohlavní rozmnožování pučením a dělením • na pevných půdách kolonie podobné bakteriálním rody Candida, Trichosporon, Cryptococcus etc. B) Vláknité houby (plísně) • složeny ze soustavy hyf (mycelium) jednobuněčné/mnohobuněčné • nepohlavní rozmnožování rozrůstáním hyf, nebo vegetativní „spory“ • na pevných půdách vláknité povlaky (hyalinní mikromycety – Aspergillus, Fusarium…, zygomycety - Rhizopus, Mucor. . , pigm. mikromycety –Scedosporium, Alternaria. . , dermatofyta –Trichophyton, Microsporum. . )

1. Názvosloví hub v klinické praxi…. C) Dimorfní houby • růst ve dvou formách (kvasinkové a vláknité) v závislosti na teplotě • importované (endemické) mykózy (Severní i Jižní Amerika, Dálný Východ) rody Histoplasma, Blastomyces. . D) Ostatní • přeřazeny z parazitů díky studiu genomu • nekultivovatelné (nebo obtížně) Pneumocystis jiroveci, Microsporidium spp. . .

1. Houby - zástupci Candida Fusarium Rhizopus Geotrichum

1. Houby - zástupci Candida Fusarium Irpex lacteus Rhizopus Geotrichum

2. Patogeneze mykóz Houby až na výjimky (dermatofyta, endemické mykózy) nejsou primárně patogenní (mohou kolonizovat kůži i GIT…), ale jsou oportunními patogeny což znamená, že ke vzniku onemocnění (invazivního/neinvazivního) napomáhá přítomnost nějaké predispozice hostitele tedy tzv. rizikové faktory (onkologická onemocnění a jejich léčba, léčba kortikoidy, diabetes, pobyt na JIP, nezralí novorozenci – ale i léčba antibiotiky, vlhká zapářka apod) Pro vznik život ohrožujících - invazivních infekcí - je největším rizikem neutropenie (obrana organismu proti houbám závisí nejvíce na buněčné imunitě)

2. Mykózy - rozdělení Celkové infekce (invazivní) sepse (nejč. kandidové), pneumonie (nejč. aspergilové), diseminované mykózy Lokální infekce (povrchové a slizniční) infekce kůže, kožních adnex a sliznic (dermatomykózy a kandidózy) Mykotoxikózy obvykle alimentární otravy způsobené toxiny hub (Claviceps purpurea, Aspergillus. . ), které kontaminují potravu (ergotismus-námel, aflatoxiny. . ) Alergická onemocnění přecitlivělost na části hub (konidie, části hyf. . )

3. Antimykotika (léčba mykóz) Dle použití • lokální • celková Dle struktury molekuly • alyeny (amfotericin a jeho lipidové formy, nystatin) • azoly (flukonazol, itrakonazol, vorikonazol, clotrimazol. . ) • echinokandiny (caspofungin, micafungin, anidulafungin) • antimetabolity (flucytosin) • alylaminy • ostatní (terbinafin) (k. undecylová, ciclopiroxolamin)

s rd a r in # of drugs XMP Anidulafungin Casp ofun gin Medical Mycology: The Last 50 Years ter Gr icin ise B ofu (19 58 lvi ) n sta t Amin ph o Ny n o uc v a R Micafungin L-Am. B Po Vo sa ricon ABCD azol co n a ABLC Terbinafine zol Itraconazole Fluconazole Ketoconazole Miconazole So 5 -FC l o az

3. Alyeny – změna permeability buněčné membrány (vazba na ergosterol) Amphotericin B, jeho lipidové formy, nystatin Ergosterol Binding to ergosterol, Intercalation of cell membrane Ca++ Na+ Ca++ K+ Na+ K+ nefrotoxické Leakage of intracellular cations and proteins

3. Azoly – inhibice syntézy ergosterolu (cytochrom P 450) Azole (flukonazol, vorikonazol, posakonazol. . ) Cell membrane Ergosterol Synthesis Pathway Squalene Accumulation of toxic sterols in cell membrane Toxic sterols Inhibition of 14 -alpha-demethylase hepatotoxické, mnoho interakcí, monitorace hladin

3. Echinokandiny – inhibice syntézy glukanu Mannoproteins ß(1, 6)-glucan ß(1, 3)-glucan Chitin Phospholipid bilayer of cell membrane ß(1, 3) glucan synthase inhibitor takřka bez nežádoucích účinků, drahé Inhibition of ß(1, 3) glucan synthase

4. Vyšetřovací metody v klinické mykologii 1. Mikroskopické metody 2. Kultivační metody 3. Sérologie (stanovení antigenu, protilátky) 4. Molekulárně-biologické metody (nestandardní)

4. Mikroskopické metody A) nativní preparát • často v KOH, lze dobarvit buď nespecificky (Lugol), nebo specificky (Myco. Ink, Rylux – vážou se na chitin) • kultury Myco Ink A. fumigatus (kultura) Calcofluor, Rylux (fluorescenční) C. parapsilosis –rýžový agar (kultura)

4. Mikroskopické metody B) fixovaný preparát • obecná barvení (Gram) • speciální barvení (imunofluorescence, Groccot, Gram. Weigert …) Kandidémie - Gram Punktát z jater - Gram

4. Mikroskopie – shrnutí Výhody: • rychlost (minuty) • relativně nízká cena vyšetření • specificita, riziko kontaminace není velké, ale může být pozitivní i v případech, kdy houba již není životaschopná (př. dermatomykóza) Nevýhody: • malá senzitivita, pozitivní obvykle až pozdějších stádiích onemocnění • v materiálu lze většinou jen orientačně zařadit patogena do rodu nebo skupiny (septované x neseptované)

4. Kultivační metody Kultivační média - pevná - tekutá Kultivační teplota 37+/-1ºC, 30+/-1ºC, 25+/-1ºC nejběžnější médium pro mykologii: Sabouraudův agar s glukózou s antibiotiky (pro zabránění růstu „rychlejších“ bakterií) další speciální média: chromogenní agar (dourčení kvasinek) rýžový agar (dourčení kvasinek) RPMI 1640, MH s glukózou a metylenovou modří (testování citlivosti) Czapek Dox (dourčení aspergilů) atd.

4. Kultivační metody zařazení kultivátů do rodu a druhu • makro a mikromorfologie (vzhled kolonií, tvorba mycélií a pseudomycélií na rýžovém nebo bramborovém agaru, tvar buněk v mikroskopickém preparátu. . ) • biochemické vlastnosti (utilizace a kvašení cukrů, event. dalších látek, komerční „chromagary“) • sekvenace (PCR), proteomika (MALDI-TOF)

4. Testování citlivosti hub k antimykotikům • Stále není zcela prokázaný vztah mezi výsledky in vitro a in vivo houby rostou pomaleji než bakterie (difuze ATM v agaru x růst mikroorganismu) stavba buňky (eukaryota) a složení (chitin) • Existují standardní metodiky – CLSI, EUCAST (M 27 -A pro kvasinky, M 37 -A pro vláknité houby, M 44 -A, E 7. 1) pracné, drahé a v rutinně nepoužívané (krom DDT, která je ale použitelná jenom pro některá ATM) • V rutinní praxi lze využít pomocné metodiky s různou shodou se standardními (ETEST, Sensititre, Neo. Sensitabs…)

4. Příklad: metodika ETEST (vysoká shoda se standardem) Princip: stanovení MIC (minimální inhibiční koncentrace) pomocí plastikového proužku s gradientem antimykotika

4. Kultivace – shrnutí Výhody: • umožní zařadit patogena do rodu i druhu (epidemiologie) • otestovat citlivost na antimykotika • specifická (z primárně sterilních materiálů) Nevýhody: • • málo senzitivní (ale víc než mikroskopie) časově náročnější (dny až týdny) riziko kontaminací (pomnožení) u nesterilních materiálů obtížná interpretace – rozhodnutí o kolonizaci nebo infekci (moč, sputum etc. )

4. Sérologie (dg invazivních mykóz) Ø antigeny buněčné stěny hub (v našich podmínkách) invazivní aspergilóza invazivní kandidóza invazivní kryptokokóza invazivní mykóza Ø galaktomannan glukuronoxylomannan glukan protilátky invazivní kandidóza antimannan Pro dg invazivních mykóz není stanovení protilátek obvykle přínosné (velká promořenost obyvatelstva) Výjimka – endemické mykózy (histoplazmóza, kokcidioidomykóza apod. )

4. Sérologie (dg invazivních mykóz) prognózu pacienta s invazivní mykózou je zásadní časné zahájení léčby velký důraz je kladen na časnou diagnostiku (tj. serologické a molekulárně-biologické metody) mortalita IA & čas zahájení léčby Von Eiff, Respiration, 1995

4. Používané metody • Latexová aglutinace (kryptokokóza, histoplazmóza…. ) • ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) (kandidóza, aspergilóza…. . ) • G-test (limulus test) (panfungální – vše kromě kryptokoků a zygomycet) • Komplement-fixační reakce, hemaglutinace, imunodifuze v gelu. . (protilátky mají význam u alergických stavů a endemických mykóz…. )

4. Latexová aglutinace - princip v přítomnosti antigenu vznik okem viditelného aglutinátu

4. Sendvičová ELISA – princip 1 Galactomannan 2 Rat monoclonal antibody EBA 2 + peroxidase Rat monoclonal antibody EBA 2 Mennink-Kersten et all, 2004 3 Chromoge n 4

4. G-test - princip Limulus polyphemus (S. Amerika) Tachypleus tridentatus (JV Asie)

4. Nekultivační (sérologické) metody shrnutí Výhody: • • • rychlé (časná diagnóza) senzitivní specifické možnost monitorovat léčebnou odpověď (v případě antigenů) vysoká negativní prediktivní hodnota! (tj. negativní výsledek s vysokou pravděpodobností znamená nepřítomnost choroby) Nevýhody: • falešné pozitivity • nejednoznačná interpretace (u protilátek) • cena (G-test)

4. Molekulárně biologická diagnostika - výhody Ø velmi citlivá – může detekovat jen několik kopií genu v reakci a dokonce méně než jeden genom. Ø lze využít jak konzervované, tak variabilní úseky genomu a tak navrhnout assay panfungální nebo specifickou pro určité rody nebo druhy. Ø kvantifikací lze odlišit kolonizaci od aktivní infekce. Ø při použití multiplex PCR lze detekovat více druhů v jedné PCR reakci. Ø výsledek je znám během několika málo hodin.

4. Molekulárně-biologická diagnostika - nevýhody Falešné negativity z důvodu: Ø málo účinné metodě izolace DNA Ø velkému nadbytku humánní DNA ve vzorku (kompetice) Falešné pozitivity z důvodu: Ø kontaminace (při odběru, izolaci DNA, přípravě PCR reakce) Ø nízké specificitě (zkřížené reakce s jinými příbuznými druhy nebo dokonce lidskou DNA)

5. Nejčastější mykózy Kandidózy Aspergilózy Zygomykózy Fusariózy Kryptokokózy Pneumocystózy Dermatomykózy Vzácné houbové infekce invazivní neinvazivní

5. Epidemiologie invazivních mykotických infekcí zastoupení houbových patogenů je různé u různých skupin pacientů…… (např. u onkologicky nemocných se zvyšuje podíl infekcí způsobených vláknitými houbami) (Pfaller 2010)

5. Epidemiologie neinvazivních mykotických infekcí 1. mykózy kůže a nehtů nohou (dermatomykózy) • vůbec nejčastější mykotické onemocnění • dokonce čtvrté nejčastější onemocnění obecně (po zubních kazech, vysokém tlaku a migréně) 2. vulvovaginální kandidózy (slizniční kvasinkové infekce) • • druhá nejčastější poševní infekce 75% žen prodělá za život alespoň jednu epizodu asi polovina z nich onemocní dvakrát predispoziční faktory (těhotenství, diabetes mellitus, léčba širokospektrými antibiotiky, chlorované bazény, těsné syntetické prádlo…)

5. Kandidóza Původci: • C. albicans (% v závislosti na populaci pacientů) • ostatní kandidy – ale i rod Trichosporon, Blastoschizomyces, Saccharomyces etc. Infekce: • invazivní – sepse nebo diseminovaná infekce • neinvazivní - onychomykóza, kožní kandidóza, vaginální kandidóza… V malém množství patří kvasinky do běžné flóry kůže či GIT, z čehož plyne, že kandidózy jsou obvykle endogenního původu Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie • běžné bakteriologické metody nekultivační • glukan • PCR

5. Aspergilóza Původci: Aspergillus fumigatus (90%) Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus tereus… Infekce: • invazivní - nejčastěji plicní, možnost diseminace hematogenně • neinvazivní – onychomykózy, otomykózy, alergická broncho-pulmolární… Na rozdíl od kvasinek nejsou aspergily součástí běžné flóry člověka a infekce jsou tedy obvykle exogenního původu (stavební práce!!) Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie • ne biochemie - ale mikromorfologie, MALDI nekultivační • galaktomanan, glukan • PCR

5. Zygomykóza Původci: Rhizopus spp. (až 50%) Mucor spp. , Absidia spp. , Rhizomucor spp. , Cunninghamella spp. Infekce: • invazivní - rhinocerebrální, plicní, sinusitidy, možnost diseminace hematogenně • neinvazivní – onychomykózy, otomykózy… exogenní (stejně jako aspergilózy), méně časté Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie • ne biochemie - ale mikromorfologie, MALDI nekultivační • bez serologických metod!! • PCR

5. Fusarióza Původci: Fusarium solani (až 50%), F. oxysporum, F. verticillioides… Infekce: exogenní kožní, keratitidy (čočky), pneumonie, sinusitidy - u imunokompromitovaných až v 70% diseminace!! Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie • ne biochemie – ale mikromorfologie • u diseminovaných pozitivní hemokultura!! nekultivační • glukan • PCR? !

5. Kryptokokóza (invazivní) Původce: C. neoformans, C. gatii Infekce: exogenní (rezervoár- holubí trus) primárně plicní, při diseminaci má afinitu k CNS (meningitidy), často první příznak rozvíjejícího se AIDS Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie • v mikroskopickém preparátu typické polysacharidové pouzdro • kultivace – běžné půdy nekultivační • glukuronoxylomanan • PCR

5. Pneumocystová pneumonie Původce: P. jiroveci (na počest českého parazitologa prof. Jírovce) – původně parazit, přeřazeno k houbám na základě studia genomu Infekce: exogenní (ubikvitní), plicní, často první příznak rozvíjejícího se AIDS, komplikace u neutropenických pacientů Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie: • speciální mikroskopická barvení • imunofluorescence • běžně se nekultivuje nekultivační: • glukan (krev, tekutina z BAL) • PCR (tekutina z BAL) © E. Keiser

6. Povrchové mykózy Dle kliniky • Dermatofytózy (tinea – dle lokalizace capitis, corporis, manus, pedis, unguium - onychomykóza…) • Kandidózy • Keratomykózy (Pityriasis versicolor) Dle původce • Tinea (Trichophyton spp. , Epidermophyton floccosum, Microsporum spp. , Scopulariopsis spp. ) • Kandidóza (C. albicans, C. parapsilosis, T. asahii, C. albidus. . ) • Keratomykóza (Malassezia furfur. . ) Mikrobiologická diagnostika • Kultivace (dle původce – obvykle Sabouraudův agar, 25 -30ºC, až 1 -5 týdnů) • Mikroskopie (preparát s Myco. Ink a KOH)

Závěry – co byste měli vědět rozdíl bakterie x houby, jak se dělí mikrobiologická diagnostika (mikroskopie, kultivace, sérologie, PCR) mykózy (invazivní x neinvazivní) nejpočetnější (kandidózy, aspergilózy, dermatomykózy) v diagnostice je nutný komplexní přístup (rizikové faktory x klinický stav x mikrobiologie)

Kazuistika k zamyšlení Muž, r. 1960 30. 1. 2013 31. 1. 2013 hospitalizován s pneumonií dg. influenza A nasazen oseltamivir + empiricky piperacilin/tazobaktam pro susp. bakteriální superinfekci 5. 2. 2013 tekutina z BAL na GM – negativní (odběr pro ne zcela dobrou odpověď na terapii) 13. 2. 2013 přidán anidulafungin (vysazen 21. 2. 2013) 26. 2. 2013 po předchozím pozvolném zlepšování stavu opět zhoršení s kultivačním nálezem v moči (E. coli - cefotaxim) 28. 2. 2013 pozitivní hemokultura, mikroskopicky kvasinky 4. 3. 2013 hlášen výsledek C. neoformans (API 32 C, sekvenačně potvrzeno) – změna na amfotericin + flukonazol 4. 3. 2013 LFA sérum pozitivní, 5. 3. LFA moč pozitivní 6. 3. 2013 LFA likvor pozitivní, později i kultivačně pozitivní HIV negativní, bez kortikoidů, bez defektů v buněčné imunitě, v předchorobí bez zvláštností. Navzdory terapii pacient 3. 4. 2013 umírá

Otázky ü smíšená pneumonie od začátku hospitalizace? ? ? ü původně jenom kolonizace kryptokokem a až následně rozvoj kryptokokózy na terénu poškozeném chřipkou? ? ? ü nozokomiální nákaza? ? ? Poučení pro nás: u pacientů dlouhodobě se nelepšících na odpovídající terapii je vhodné brát v úvahu i houbovou etiologii infekce (a to včetně kryptokoka) bez ohledu na imunitní stav pacienta….