Lipopoliszacharidok meghatrozsa talajbl Lipopoliszacharidok LPS A Gramnegatv baktriumok

Lipopoliszacharidok meghatározása talajból

Lipopoliszacharidok (LPS) • A Gram-negatív baktériumok külső membránjának építőelemei. • Felépítésük: – Lipid (lipid A) – Poliszacharid mag – O-specifikus oldallánc • LPS zsírsavak alkotják a sejt összes zsírsavainak 15 -20%-át Gram-negatív baktériumoknál

Lipopoliszacharidok (LPS) • Saddler és Wardlow (1980. ) vizsgálták a holt baktériumok LPS-jainak gyors bomlását talajokban • LPS zsírsavak Gram-negatív baktériumok biomassza meghatározására használhatók • -hodroxi-mirisztinsavat használták LPSmeghatározásra talajban (Smith et al, 1986. ) • LPS hidroxi savak alapján is meghatározható a talajban lévő életközösség összetétele (Parker et al, 1985. )

A mérés elve • A talajmintát Bligh and Dyer eljárással extraháljuk, hogy kivonjuk a a foszfolipid zsírsavakat. Ezután savas hidrolízist végzünk, majd a felszabadult zsírsavakat észteresítjük, elválasztjuk egy szilárdfázisú kolonnán, végül a hidroxi-zsírsavakat GC-MS analízissel határozzuk meg.

Lipid extrakció 1. Talajminta szűrés kovaföld szűrőn 2. 3. 4. 5. 500 ml-es lombikba tesszük a szűrt mintát, rotációs bepárlóban szárítjuk, majd 120 ml 4 M HCl-ben oldjuk Refluxálás után (100°C, 5 óra, majd hűtés) a zagyot leszűrjük Celite 545 -ön (2 cm rétegvastagság) Anyalúg extrakciója 250 ml-es extrahálótölcsérben 60, 40 ml kloroformmal Az extraktumot (szabad zsírsavakat tartalmaz) Na 2 SO 4 felett szárítjuk, az oldószert vákuumban távolítjuk el

Szabad zsírsavak észteresítése 1. Lipid-frakció: 4 ml-es üvegcsébe öntjük, majd eltávolítjuk az oldószert 40°C-os nitrogénárammal 2. Észteresítés: 2 ml metanol: kloroform: cc. HCl (10: 1: 1 v/v) eleggyel, 60°C-on tárolás egy éjszakán át 3. Hozzáadunk: 2 ml 2%Na. Cl oldatot, 4 ml hexántoluol (1: 1 v/v) elegyet centrifugában két fázisra bontjuk 4. Ismétlés háromszor, majd Na 2 SO 4 -tal szárítás 5. Kloroform mennyiségének csökkentése bepárlással, tárolás -20°C-on

Hidroxi-zsírsavak elválasztása 1. 2. 3. 4. Hidroxi-zsírsav-metilészterek (OH-FAME) elválsztása a nemszubsztituált zsírsavaktól szilárd fázisú extrakcióval (SPE-NH 2 kolonna, 1 v. 2 g) Oszlopra: 1 rész diklorometán, majd 1 rész hexán Minta feloldása kevés hexán: diklorometán (3: 1 v/v) elegyben, majd felvitel az oszlopra Az összes foszfolipid-zsírsav-metilészer kinyerése két oszlop-térfogatnyi hexán: diklorometán (3: 1 v/v) eleggyel történik OH-FAME kinyerése két oszlop-térfogatnyi diklorometán: etilacetát (9: 1 v/v) eleggyel történik

Szilán-származék képzés Célja az analitikai mérés érzékenységének növelése. 1. 0, 5 ml frissen készített piridin: N, O-bis(trimetilszilil)-trifluoroacetamid: hexametildiszilazán: trimetil-kloroszilán (TMSi) (0, 2: 1: 2: 1 v/v) hozzáadása a megadott sorrendben, minden hozzáadás után megkeverve 2. 60°C-on melegítés 15 percig 3. Oldószer eltávolítása nitrogén-áram alatt

GC-MS meghatározás • Zsírsav-metilészterek feloldása 0, 1 ml hexánban (nonadekánt tartalmaz belső standardként 19: 0) • 1 µl-t injektálunk a GC-MS-be • Mérés SCAN vagy SIM módban • Kapilláris kolonna (50 m x 0, 2 mm i. d. , 0, 33 mm df), 5% fenil-metillel módosított szilikonváz

GC-MS meghatározás • Splitless mód • He-vivőgáz, áramlási sebesség 0, 25 ml/perc • Termosztálás: 70°C 2 percig, emelés 160°C-ra (40°C/perc), majd emelés 280°C-ra (3°C/perc), injektor 290°C • Elektronsokszorozó: U = 1800 -2000 V • Átvezető cső: 300°C

Kiértékelés • Standard: reprezentatív talajminta extraktum (tartalmaz minden jelen lévő FAME-t) • Standard mérése SCAN és SIM módban is • Az egyes OH-FAME-k mennyisége becsülhető (SCAN-mérés alapján): • Ahol: C: a vizsgált anyag mennyisége (n. M/g) Rf és Ri: a vizsgált anyag és a belső standrad által adott jel m: a belső standard mennyisége (ng) MW: vizsgált anyag molekulatömege A: injektált minta mennyisége (mg) k: a vizsgált anyag és a belső standard intenzitás-aránya

Összefoglalás • Különböző eljárásokat fejlesztettek ki a zsírsavak felszabadítására LPS-ból: savas, bázikus hidrolízisen, ill. mindkettőn alapuló eljárásokat (Wollenweber and Rietschel, 1990. ) • A leírt módszer mintegy ötször érzékenyebb a klasszikus a fenol-víz vagy trikloroecetsav módszernél. • LOD (kimutatási határ): 1 ng/g

Felhasznált irodalom • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 • Sarkadi Lívia: Biokémia mérnök szemmel, Typotex Kiadó, 2007