Lieviti ingegnerizzati per la produzione di acido lattico

Lieviti ingegnerizzati per la produzione di acido lattico: • Saccharomyces cerevisiae selvatico e privo di PDC 1 o PDC 5 • Kluyveromyces lactis selvatico e privo di Kl. PDC 1 Regolazione del metabolismo in K. lactis • Regolazione della PDC (glucosio, etanolo ed autoregolazione) • Metabolismo del piruvato: • respiratorio in aerobiosi (bioreattore): no etanolo • fermentativo in aerobiosi dei ceppi pdh (bioreattore): si etanolo • acetil-Co. A citosolico in glucosio limitante-aerobiosi dei ceppi pdh (chemiostato): no etanolo Produzione di acido lattico in ceppi pdh e pdh-pdc

Metabolismo del piruvato

STUDI METABOLICI A - Produzione biomassa e consumo glucosio Selvatico klpdc 1 klpda 1

B - Produzione di etanolo, piruvato e acetato etanolo Selvatico klpdc 1 klpda 1 acetato Selvatico klpdc 1 klpda 1 piruvato Selvatico klpdc 1 klpda 1

C - Confronto tra selvatico e doppio deleto pda 1 -pdc 1 wt ΔΔ Biomassa Etanolo wt ΔΔ Glucosio Piruvato Differenze in Biomassa prodotta e Consumo di glucosio/accumulo di piruvato

PRODUZIONE A - Vettore di espressione con marcatore dominante

B - Produzione di acido lattico in ceppi pda 1 deleti Resa massima ottenuta 0. 35 g/g Competizione con la PDC Produzione eterolattica (etanolo e lattato) Costruzione di un ceppo prototrofo pda 1 -pdc 1 deleto con p. LAZ 10: pdc 1 +p. LAZ 10 (MATa) X wt (MAT ) pdc 1 +p. LAZ 10 (MAT ) X pda 1 pdc 1 (MATa) + p. LAZ 10

Produzione lattato in bioreattore Product yield = 0. 85 -0. 88

Osservazioni • Il lattato viene prodotto solo dal glucosio (no glucosio, no lattato) • Concentrazione a 500 ore: 60 g/l lattato; continua? • Rese quasi teoriche (1 g/g), più alte che in pdc 1 (0. 58) e pda 1 (0. 35) • Attività più alte che in wt e pdc 1 (no autoregolazione) Bianchi MM et al. Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed wih the heterologous LDH gene (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67: 56215625