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Licenciatura em Biologia Humana Últimas notícias do “El Dorado” das células pluripotentes induzidas (i. PS’s) 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Júri: Prof. Fernando Capela Prof. Paulo de Oliveira Elaborado por: Maria Ferreira nº 27496 Mariana Ascensão nº 27756 Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012

“Stem Cells” Diferenciar em células especializadas Autorrenovar Células indiferenciadas Embrião 2 Fontes Tecidos adultos

“Stem Cells” De acordo com o tipo de células que podem gerar dividem-se em: � Totipotentes � Pluripotentes � Multipotentes � Oligopotentes � Unipotentes Figura 1 – “Stem cells” pluripotentes

Células i. PS “Stem cells” pluripotentes derivadas artificialmente de células não-pluripotentes pela indução de uma manifestação “forçada” de certos genes Não são obtidas a partir do embrião, mas sim de células diferenciadas

História das células i. PS Yamanaka (2006) – 1ª vez que se geraram i. PSCs a partir de fibroblastos de ratinhos � Foram isolados 4 genes essenciais para a produção de “stem cells” Yamanaka (2007) – descobriu que: � Nanog um dos principais determinantes da pluripotência celular � c-Myc é oncogénico

História das células i. PS Yamanaka (2007) – transformou fibroblastos humanos em células i. PS’s Hochedlonger (2008) - utilizou um adenovírus para transportar os 4 TF para o DNA de célula da pele e fígado de ratinhos Yamanaka (2008) - concluiu que se poderiam transferir os 4 genes necessários com um plasmídeo Figura 2 - Yamanaka

História das células i. PS Freed (2009) – demonstrou outra vantagem do adenovírus Morrisey (2011) – usou micro. RNAs, melhorando a eficiência da reprogramação

Produção de células i. PS Células para reprogramação: � Eficácia, período de tempo e extensão da reprogramação varia conforme as células iniciais Tecidos da medula óssea são uma fonte de “stem cells” Cirurgia invasiva e dolorosa

Produção de células i. PS Figura 3 – Indução de i. PSC’s

Produção de células i. PS Células Adultas Geração de i. PSC Células adultas podem ser reprogramados para um estado pluripotente pela expressão “forçada” de alguns fatores embrionários de transcrição

Produção de células i. PS Eficiência da produção extremamente baixa Se forem usados vírus poderá haver alteração genética das células e a expressão de oncogenes pode ser acionada i. PSC’s são tipicamente derivadas por transfecção de certas células Exemplo: Fibroblastos

Influência do estado de diferenciação das células O estado de diferenciação da célula alvo influencia a suscetibilidade para a reprogramação e para o potencial de diferenciação das i. PSC’s daí derivadas Stem cells de músculo de rato reprogramam com maior eficiência que as suas células filhas mais diferenciadas (mioblastos e fibroblastos)

Genes de indução Geração de i. PSC’s Genes utilizados para a indução depende Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna impossível a indução � Oct-3/4 � Sox 2

Genes de indução Fatores adicionais para ↑ eficiência da indução: � Klf 4 � c-Myc oncogénico � Nanog � LIN 28 Transferência dos 4 TF, exceto c-Myc Células Adultas Processo: Células i. PS � + lento � - eficaz � Não se desenvolve cancro

Genes de indução Oct-3/4 � Papel crucial na manutenção da pluripotência � Ausência → conduz à diferenciação Sox 2 � Semelhante � Expresso ao Oct-3/4 → mantém pluripotência em “stem cells” pluripotentes e unipotentes Klf 4 � fator capaz de gerar células i. PS

Genes de indução c-Myc � Mostrou-se desnecessários para a geração de i. PSC’s humanas � Oncogene → por isso o seu uso é preocupante Nanog � Necessário para promover pluripotência � Poder de renovar “stem cells” � Ausência → rápida diferenciação � Desnecessário para a indução LIN 28 � Fator de geração de i. PSC’s � Desnecessário

p 53 Proteína supressora de tumores Principal inibidora da geração de células i. PS Liga-se diretamente ao promotor do Nanog para suprimir o seu nível de expressão Inicia-se a diferenciação de “stem cells” em células adultas Deleção do gene p 53 de i. PSCs em 1000 x ↑ eficiência de geração

p 73 Proteínas envolvida na geração de células i. PS humanas Possui 2 promotores alternativos: � TAp 73 funções semelhantes à p 53 � DNp 73 inibe o p 53 e o p 73 ↑a expressão Nanog pode ↑ eficiência da geração de i. PSC’s humanas células geradas com a sua expressão + resistentes à diferenciação (in vitro e in vivo)

DNp 73 Os 2 promotores da p 73 têm papéis opostos Lin et al descobriu que a adição do gene humano de DNp 73 ↑ a geração de i. PSC’s Condições basais: • Oct-3/4 • Sox 2 • Klf 4 Condições basais • c-Myc + DNp 73 Gráfico 1 – Colónias de i. PSC humanas

DNp 73 Contribui diretamente para a expressão do Nanog e do Oct-3/4 Manutenção da pluripotência Gráfico 2 – Expressão de fatores de transcrição

Proteínas recombinantes Até 2009, todos os métodos desenvolvidos envolviam a utilização de materiais genéticos Possibilidade de ocorrerem modificações genéticas Tumores Hongyan et al Utilizaram proteínas recombinantes capazes de reprogramação celular pi. PSC’s

Proteínas recombinantes Hongyan et al Autorrenovam-se pi. PSC’s Pluripotentes in vitro e in vivo Evitam introdução de modificações genéticas

Proteínas recombinantes pi. PSC’s � Foram criadas em ratinhos Indistinguíveis das “stem cells” embrionárias � Exigem métodos de aperfeiçoamento � Representa métodos um avanço em relação aos outros Vantagens

Proteínas recombinantes Vantagens: � Elimina o risco de modificar o genoma da célula-alvo Oferece um método para gerar i. PSC’s + seguras � Confere uma abordagem + simples e + rápida � Poderia potencialmente permitir a aplicação de uma metodologia de reprogramação mais ampla e mais económica produção de proteína recombinantes em larga escala

Obstáculos Reduzido número de células Falta de metodologias simples Custos Rendimento Inserção genómica Rejeição Imunológica Teratomas

Vetores Alternativos Plasmídeos – evita vírus, necessita de oncogenes e é menos eficiente Adenovírus Adenovíru – não incorpora os seus genes no hospedeiro alvo e necessita de pouco tempo de apresentação Proteínas recombinantes

Semelhanças entre i. PSC’s e ‘stem cells’ Propriedades celulares biológicas: Morfologia – forma redonda, nucleótidos grandes e citoplasma escasso Propriedades de crescimento – tempo de duplicação e atividade mitótica Marcadores de stem cells - i. PS humanas expressam os marcadores específicos para h. ESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1 -60, TRA-1 -81, TRA 2 -49/6 E e Nanog Genes de ‘stem cells’ – Oct-3/4, Sox 2, Nanog, GDF 3, REX 1, FGF 4, ESG 1, DPPA 2, DPPA 4 e h. TERT Atividade da telomerase – h. ESCs expressam alta atividade de telomerases para sustentar a autorrenovação e proliferação e assim como as i. PS

Semelhanças entre i. PSC’s e ‘stem cells’ Plutipotência: Diferenciação neural – i. PS diferenciadas em neurónios, expressando βIII-tubulina, tirosina hidroxilase, AADC, DAT, Chat, LMX 1 B e MAP 2 Diferenciação cardíaca – i. PSC diferenciadas em cardiomiócitos Formação de teratomas Quimeras de ratinhos Complementação tetraploide

Vantagens e desafios das i. PSC’s Grande plasticidade celular Não geram riscos de rejeição imune Possibilidade de modelos de doenças in vivo Possibilidade de reparação de doenças por mutações A eficácia de indução de i. PSC’s é muito baixa dando origem a células insuficientemente reprogramadas

Medicina personalizada A tecnologia das i. PS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, personalizada a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos Uso de i. PSC’s para a terapia de doenças incuráveis: incuráveis produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica

Medicina personalizada O transplante de órgãos exige disponibilidade de tecidos e tratamento com imunossupressores As i. PSCs humanas poderiam ser induzidas nos tipos de células desejados e seriam geneticamente compatíveis com o paciente Surgiram discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos, nomeadamente para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos – Questão ética

Um futuro aberto É necessário superar a barreira que está entre a eficiência e a integração genómica. Caracterização proteómica de i. PSC’s. Uso de i. PSC’s para identificar fármacos terapêuticos capazes de resgatar um fenótipo. Por exemplo, linhas de células i. PS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), onde o gene p 63 está mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatado.

Potenciais aplicações das i. PSC’s Modelação de doenças Descoberta de fármacos Terapia genética Terapia de substituição/reprogramação Terapia para o Parkinson Terapia para reparação cardíaca Terapia para reparação hepática

Conclusões Estas técnicas de geração de células i. PS são revolucionárias pois, anteriormente só se podiam obter células pluripotentes a partir do embrião e agora, é possível obtê-las a partir de células adultas. A eficiência das i. PSC é muito baixa insuficientemente rerogramadas células

Conclusões A utilização de vírus pode levar a alterações genómicas Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna impossível a indução Importante descoberta para a terapêutica.

FIM

Biografia Lin et al. DNp 73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13: 9 TAN, Kah Yong et al. Efficient Generation of i. PS Cells from Skeletal Muscle Stem Cells. PLo. S ONE. Outubro 2011; vol. 6 ZHOU, Hongyan et al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Press. Maio 2009

Fonte das imagens Figura 1 - “Stem cells” pluripotenes em http: //dererummundi. blogspot. pt/2008/03/clulas-estaminais-eexpresso-gnica. html Figura 2 – Yamanaka em http: //www. gladstone. ucsf. edu/gladstone/site/publicaffairs/content/1/ 648 Figura 3 – Indução de i. PSC’s em http: //en. wikipedia. org/wiki/File: Induction_of_i. PS_cells. svg Gráfico 1 - Colónias de i. PSCs humanas em Lin et al. DNp 73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13: 9 Gráfico 2 - Expressão de fatores de transcrição em Lin et al. DNp 73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13: 9