Lezioni di biotecnologie 2 Lezione 5 Biotecnologie per

Lezioni di biotecnologie 2

Lezione 5 Biotecnologie per i bisogni della società 3 © Zanichelli editore, 2014

Biotecnologie nei processi produttivi Le biotecnologie offrono l’opportunità di rispondere alle esigenze della società. Nei processi produttivi: • migliore rendimento; • minore impatto ambientale; • riduzione dei costi; • accessibilità a nuovi prodotti non ottenibili in modi diversi. Nei bisogni: • nuove fonti di cibo, anche ad arricchito valore nutrizionale; • nuove fonti di energia a basso inquinamento; • nuove applicazioni (ad es. in ambito forense). 4 © Zanichelli editore, 2014

Biotecnologie e agricoltura Le biotecnologie in agricoltura vengono utilizzate per il miglioramente genetico delle specie di interesse economico. Le finalità possono essere: • generare nuove varietà non ottenibili con gli incroci tradizionali; • correggere difetti nelle varietà agricole esistenti. Le specie più comunemente utilizzate sono: mais, orzo, riso, frumento, cotone, soia, patata, pomodoro, girasole, barbabietola. © Zanichelli editore, 2014

Applicazioni delle varietà transgeniche Le principali applicazioni delle piante transgeniche sono: • migliorare i processi di maturazione; • resistenza agli erbicidi; • resistenza agli stress (freddo, salinità, siccità); • resistenza ai patogeni (virus, funghi, batteri, insetti); • modificare il contenuto nutrizionale (carboidrati, proteine); • produzione di proteine esogene ricombinanti (enzimi, anticorpi, antigeni per vaccini). 6 © Zanichelli editore, 2014

Manipolazione genetica di piante In campo agricolo, la maggior parte delle trasformazioni sono di tipo knock in, ovvero prevedono l’introduzione di geni esogeni attraverso le seguenti fasi: 1. clonaggio del gene di interesse; 2. inserimento del gene in un opportuno vettore; 3. introduzione del gene nel genoma della pianta ricevente; 4. selezione delle piante trasformate e verifica dell’espressione del gene e del fenotipo. 7 © Zanichelli editore, 2014

Agrobacterium tumefaciens Uno dei metodi più utilizzati per inserire geni esogeni in piante sfrutta il plasmide Ti del batterio Agrobacterium tumefaciens, un batterio che infetta le piante causando un’escrescenza tumorale detta galla del colletto. Una pianta infettata dal batterio 8 © Zanichelli editore, 2014

Trasformazione con A. tumefaciens (I) Il plasmide Ti contiene: • un segmento di DNA (T-DNA) che viene trasferito nelle cellule vegetali dal batterio e codifica per oncogeni che ne causano la crescita incontrollata; • la regione Vir che codifica per i fattori di virulenza; • sequenze specifiche per la replicazione. 9 © Zanichelli editore, 2014

Trasformazione con A. tumefaciens (II) I vettori basati sul plasmide Ti mancano dei geni per la crescita tumorale, ma mantengono quelli della regione Vir. 1. Una volta clonato il gene di interesse nel vettore Ti, questo viene inserito in A. tumefaciens; • Il batterio con il plasmide ricombinante viene usato per infettare la pianta ospite (solitamente partendo da un’incisione praticata nel tessuto vegetale); 10 © Zanichelli editore, 2014

Trasformazione con A. tumefaciens (III) 3. A seguito dell’infezione, il T-DNA in cui è inserito il gene esogeno è trasferito al genoma delle cellule vegetali; 4. Il tessuto infetto viene espiantato e coltivato in vitro per rigenerare una piantina che esprimerà il transgene. 11 © Zanichelli editore, 2014

Trasformazione biobalistica Non tutte le piante sono infettabili da A. tumefaciens. In alternativa si può utilizzare il metodo biobalistico. Si tratta di un apparecchio detto cannone genico (gene gun) che genera un flusso ad elevata velocità di microparticelle in grado di penetrare nei tessuti vegetali. 12 © Zanichelli editore, 2014

Gene gun • Nel gene gun sono caricate microsfere di oro o tungsteno (1 -4 µm di diametro) che possono essere coniugate al DNA da trasferire. • Un getto di aria compressa o l’esplosione di polvere da sparo proietta le microsfere all’interno dei tessuti vegetali (calli, embrioni, meristemi). • Il DNA “sparato” viene integrato casualmente nel genoma della cellula vegetale. • I tessuti trasformati vengono coltivati in vitro per ottenere le piantine transgeniche. 13 © Zanichelli editore, 2014

Esempi di piante OGM (I) Resistenza agli erbicidi: mais, cotone, soia, trasformati con i geni batterici Bar di Streptomyces e Bxn di Klebsiella, che codificano enzimi degradativi. Resistenza a stress: mais trasformato con il gene della MAP chinasi della pianta Arabidopsis che conferisce resistenza a freddo, caldo e salinità. Il gene Bxn del batterio Klebsiella pneumoniae permette alle colture transgeniche lo esprimono di resistere all’irrorazione di Bromoxynil, un potente erbicida. 14 © Zanichelli editore, 2014

Esempi di piante OGM (II) Resistenza ai patogeni: tabacco, zucchine, melone trasformati con la proteina del rivestimento (CP) del virus del mosaico del tabacco (TMV). Questa proteina induce una risposta protettiva al TMV nella pianta (un meccanismo analogo alla vaccinazione negli animali); cotone e mais trasformati con il gene della tossina Bt del Bacillus thuringiensis che conferisce resistenza a molti insetti parassiti. La piralide del mais può danneggiare gravemente i raccolti senza difese 15 © Zanichelli editore, 2014

Il mais Bt esprime la tossina del B. thuringensis, che è letale per gli insetti ma totalmente innocua per l’uomo e presenta numerosi vantaggi: • Vantaggi sanitari: il mais GM del tipo Bt accumula un minor numero di tossine di origine fungina, le fumolisine. • Vantaggi ambientali: necessita di un uso molto inferiore di insetticidi. • Vantaggi economici: ha una resa per ettaro di circa il 20% superiore rispetto al mais tradizionale. Cristalli della tossina Bt al microscopio 16 © Zanichelli editore, 2014

Il Golden Rice è una varietà di riso geneticamente modificato per esprimere 4 geni batterici per la sintesi di beta-carotene, un precursore della vitamina A. I chicchi di questi riso arricchiti di beta-carotene (che conferisce la colorazione giallo-oro da cui il nome) possono essere utilizzati per l’alimentazione in aree povere del mondo dove la carenza di vitamina A nei bambini e nelle donne gravide causa 800 000 morti all’anno. A sinistra riso normale, a destra il Golden Rice 17 © Zanichelli editore, 2014

Diffusione delle piante GM La coltivazione di OGM è diffusa in tutto il mondo. I principali produttori sono: • USA: 69 milioni di ettari (mais, soia, cotone, barbabietola); • Brasile: 30 milioni di ettari (mais, soia, cotone); • Argentina: 23 milioni di ettari (mais, soia, cotone); • India: 10 milioni di ettari (cotone); • Canada: 10 milioni di ettari (mais). Superficie coltivata con piante transgeniche nel mondo 18 © Zanichelli editore, 2014

Problematiche delle coltivazioni OGM • Possibili rischi di incrocio con varietà naturali in campo; • possibili fenomeni allergici alle proteine esogene nei consumatori; • rischio di monopolio da parte di pochi grandi produttori di sementi OGM; • normativa non omogenea nei vari Paesi sulla brevettazione di tecniche, geni, varietà OGM. Ad oggi non sono emersi per rischi per la salute alla luce delle risultanze scientifiche, ma l’attenzione deve rimanere. Esistono organi di controllo nazionali e internazionali che vigilano sulla produzione di piante OGM. 19 © Zanichelli editore, 2014

Biotecnologie e ambiente Le biotecnologie permettono di sviluppare processi produttivi maggiormente eco-compatibili e di rispondere ad esigenze di tutela dell’ambiente. In particolare queste applicazioni si riferiscono a: • produzione di energia da biomasse; • biodegradazione di inquinanti. 20 © Zanichelli editore, 2014

Energia dalle biomasse I biocarburanti sono combustibili derivati non dalle fonti fossili (carbone, petrolio), ma da biomasse vegetali. I vantaggi sono: • la rinnovabilità della fonte (non si esauriscono come i giacimenti di combustibili fossili); • il bilancio neutro della CO 2 (quella rilasciata dalla combustione è pari a quella sottratta durante la crescita della pianta); • la biocompatibilità (i biocarburanti sono totalmente biodegradabili). 21 © Zanichelli editore, 2014

I biocarburanti principali sono : • il bioetanolo prodotto dalla fermentazione di varietà ricche di carboidrati (canna da zucchero, mais, frumento, orzo); • Il biodiesel prodotto da piante oleose (soia, palma, colza); • Il biometano prodotto dalla fermentazione anaerobica di materiale organico; • Il bioidrogeno prodotto dalla fissazione di azoto o fotosintesi da parte di alghe e batteri. 22 © Zanichelli editore, 2014

Biotecnologie e biocarburanti Le biotecnologie possono migliorare la produzione di biocarburanti. A livello delle piante: • aumentando il contenuto di carboidrati o di oli attraverso la modificazione dei geni del metabolismo; • aumentando l’efficienza di crescita mediante la generazione di varietà più resistenti o migliorando la fotosintesi e l’utilizzazione dell’azoto. A livello dei microrganismi • generando OGM in grado di digerire la cellulosa o di effettuare una più efficiente fermentazione anaerobica, fotosintesi o fissazione dell’azoto. 23 © Zanichelli editore, 2014

Biorisanamento Per biorisanamento si intende la rimozione tramite l’utilizzo di microrganismi geneticamente modificati, di inquinanti ambientali difficilmente eliminabili con tecniche chimicofisiche. Gli inquinanti oggetto di maggiore attenzione sono: • metalli (mercurio, cromo, piombo, arsenico); • idrocarburi e composti organici di origine industriale. Lo scopo del biorisanamento è rendere questi inquinanti biodegradabili da parte di microrganismi modificati. 24 © Zanichelli editore, 2014

Biorisanamento da metalli (I) Il mercurio (Hg) è uno degli inquinanti più diffusi e pericolosi, soprattutto nelle acque. Batteri E. coli sono stati ingegnerizzati per esprimere i geni batterici Mer. T e Mer. P (sistema di trasporto del Hg) e il gene MT di lievito (metallotionina, proteina in grado di chelare il Hg). Questi batteri adsorbono efficacemente il Hg dall’ambiente (importandolo grazie ai geni Mer. TP) e e lo accumulano (grazie alla proteina MT). 25 © Zanichelli editore, 2014

Biorisanamento da metalli Questi batteri possono essere usati per costruire biofiltri per la rimozione di Hg dalle acque contaminate. 26 © Zanichelli editore, 2014

Biotecnologie forensi Le biotecnologie hanno rivoluzionato anche l’investigazione scientifica: • offrendo la possibilità di amplificare minime quantità di DNA da campioni biologici o fisici tramite la PCR; • consentendo di assegnare ad ogni DNA reperito uno specifico profilo genetico. Immagine: IRRI Images 27 © Zanichelli editore, 2014

Il DNA fingerprinting (I) Per DNA fingerprinting si intende il profilo genetico (lett. impronta digitale) unico che distingue due individui, basato sulla sequenza del DNA. Il metodo oggi più utilizzato si basa sulla presenza, in ogni individuo, di un numero caratteristico di corte sequenze ripetute (short tandem repeats, STR) formate da blocchi di ripetizioni di 3 – 5 nucleotidi. Queste sequenze vengono amplificate tramite PCR dai campioni di DNA recuperati dalla scena del crimine. 28 © Zanichelli editore, 2014

Il DNA fingerprinting (II) Dopo l’amplificazione, i prodotti vengono visualizzati su gel di agarosio. Il numero di ripetizioni determina la lunghezza dei frammenti amplificati. Utilizzando primer specifici per 13 diverse STR si ottiene un profilo specifico per un determinato individuo. Le probabilità che due persone condividano l’identico profilo basato su questa tecnica è nell’ordine di 1 x 10 -20. 29 © Zanichelli editore, 2014

Il DNA fingerprinting (III) Fingerprinting di 16 persone non imparentate. La corsa elettroforetica evidenzia 19 varianti STR ordinate dal più piccolo (19) al più grande (1). Nel campione non esistono due persone che presentino la stessa coppia di varianti (alleli). 30 © Zanichelli editore, 2014

Biotecnologie etica e società Le biotecnologie come tecnica sono eticamente neutre: ha rilevanza etica invece la loro applicazione; • Questo comporta che le implicazioni debbano essere valutate caso per caso; • il dibattito etico deve sempre partire dall’analisi del rapporto rischio/beneficio: quali vantaggi derivano rispetto ai potenziali rischi; • l’applicazione biotecnologica sarà accettabile quando i vantaggi saranno superiori ai rischi. 31 © Zanichelli editore, 2014

Elementi di dibattito: vantaggi • Nel settore sanitario le biotecnologie permettono di produrre un numero crescente di medicine e servizi medici in modo più sicuro e più etico. • Nel settore agroalimentare permettono di migliorare la qualità dei prodotti alimentari e dei mangimi per animali. • Nel settore industriale, contribuiscono a migliorare l’uso delle materie prime industriali nel settore delle trasformazioni energetiche e farmaceutiche. • Dal punto di vista ambientale offrono nuovi mezzi per proteggere e migliorare l’ambiente, in particolare l’aria, il suolo, l’acqua e per attenuare il problema rifiuti. 32 © Zanichelli editore, 2014

Elementi di dibattito: quesiti aperti • Come difendere la biodiversità; • Come evitare danni inutili agli animali. • Quale protezione assicurare all’ambiente naturale e alla salute dell’uomo contro rischi derivanti da un uso improprio delle biotecnologie. • Come armonizzare l’esigenza delle attività produttive, di ricerca e di formazione e il consenso a livello individuale e sociale. • Come assicurare l’accesso alle biotecnologie dei Paesi in via di sviluppo salvaguardando le economie locali. 33 © Zanichelli editore, 2014