Lezione 25 Metabolismo delletanolo Specie reattive dellossigeno Sistemi

Lezione 25 Metabolismo dell’etanolo Specie reattive dell’ossigeno Sistemi enzimatici e vitaminici anti-ROS 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 1

Etanolo • Un liquido limpido, incolore • Rapidamente assorbito dal tratto gastrointestinale e distribuito in tutto il corpo. • Ha attività battericida ed è spesso usato come disinfettante topico. • È ampiamente usato come solvente e conservante in preparati farmaceutici. • Serve come ingrediente principale nelle bevande alcoliche. 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 2

Uso farmacologico • Per la neurolisi terapeutica di nervi o gangli – per il sollievo del dolore cronico intrattabile Meccanismo u. Si lega ai fosfolipidi e altera la struttura della membrana 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 3

Visualizzazione di un doppio strato fosfolipidico in assenza (sopra e presenza (sotto) di etanolo (5 moli %, giallo) 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 4

Visualizzazione di un doppio strato fosfolipidico in presenza di 15 moli % • L’acqua è in bianco e rosso • La membrana è completamente disordinata e forma una cavità centrale 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 5

L’etanolo al 15 % causa aumento della permeabilità della membrana • Acqua in rosso e bianco • Doppio strato vuoto (non mostrato) • Na. Cl (verde e giallo) in mezzo alla membrana Ø Si dissipa il potenziale elettrochimico del Na+ Ø la membrana si depolarizza Ø Cessano i trasporti ionici accoppiati (antiporti, simporti) • Le cellule eccitabili perdono la loro funzione • Apoptosi, citolisi 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 6

Richiamo L’etanolo ha azioni specifiche sui recettori neuronali • L’etanolo si lega direttamente ai recettori per – acetilcolina, – serotonina, – GABA – glicina (subunità alfa 1 e alfa 2) – glutammato (NMDA) • Gli effetti sedativi (iniziale euforia), depressivi e inibitori della motricità; • … vedi testi di farmacologia 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 7

Metabolismo • Rapidamente assorbito dallo stomaco ed intestino – non noto il volume di distribuzione • Ossidato nel fegato, in quattro compartimenti subcellulari 1. citosol alcol deidrogenasi 2. perossisomi Catalasi 3. microsomi Citocromo P 450 (CYP 2 E 1; Microsomal Ethanol Oxidising System) 4. mitocondri aldeide deidrogenasi • Esterificato a fosfolipidi 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 8

Assorbimento e metabolismo epatico dell’etanolo. Destino dei prodotti 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 9

La via principale del catabolismo + dell’etanolo consuma il NAD 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 10

La reazione dell’alcohol deidrogenasi 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 11

La reazione della catalasi produce acetaldeide La catalasi perossisomiale catalizza tre principali reazioni Substrati: perossido d’idrogeno, metanolo o etanolo Prodotti: acqua, formaldeide o acetaldeide • 2 H 2 O 2 → 2 H 2 O + O 2 • CH 3 OH + H 2 O 2→ CH 2 O + 2 H 2 O • CH 3 CH 2 OH + H 2 O 2 → CH 3 CHO + 2 H 2 O 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 12

La reazione di CYP 2 E 1 produce acetaldeide, ROS e prodotti della lipoperossidazione 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 13

Conseguenze dell’ossidazione dell’etanolo ad acetato 1. 2. Aumento del rapporto NADH+H+/NAD+ – Aumento del trasporto di e- e consumo di O 2 Aumento della formazione di ROS (reactive oxygen species, tra cui l’anione superossido, O 2 • –) 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 14

Il sovvertimento metabolico nell’alcolismo acuto e cronico Aumento del rapporto NADH+H+/NAD+ Aumento della formazione di specie reattive dellossigeno 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 15

Conseguenze dell’ossidazione dell’etanolo ad acetato 1. Aumento del rapporto NADH+H+/NAD+ – – – – Ø inibizione della glicolisi aumento del lattato inibizione della gluconeogenesi inibizione del ciclo di Krebs aumento della chetogenesi aumento della fosforilazione ossidativa e consumo di ossigeno inibizione della beta-ossidazione degli acidi grassi aumento della sintesi di acidi grassi e trigliceridi STEATOSI EPATICA 2. Aumento della formazione di ROS (reactive oxygen species, tra cui l’anione superossido, O 2 • –) Ø Ø Ø 26/11/2019 DANNI MOLECOLARI E CELLULARI FLOGOSI CRONICA E FIBROSI CIRROSI EPATICA ED EPATOCARCINOMA 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 16

La malattia di fegato da alcol 4 -5 “drinks” al giorno di bevande alcoliche portano alla progressiva epatopatia alcolica 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 17

fl oz = fluid ounce = oncia liquida = 0, 028 L A standard drink contiene 14 g di alcol puro 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 18

Il sovvertimento metabolico nell’alcolismo acuto e cronico Aumento del rapporto NADH+H+/NAD+ ed effetti metabolici 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 19

in assenza di NAD+ la glicolisi dipende dalla fermentazione lattica 1. 2. 3. 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA Si blocca la gliceraldeide 3 -P deidrogenasi Si attiva la lattato deidrogenasi Aumenta il consumo di piruvato 4. a digiuno assenza di gluconeogenesi 5. Ipoglicemia e Acidosi metabolica 20

In assenza di NAD+ il lattato non può essere ossidato a piruvato e la gluconeogenesi è inattiva Il lattato si accumula nel sangue acidosi metabolica 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 21

In assenza di piruvato e di NAD+ il ciclo di Krebs rallenta 1. Si bloccano le deidrogenasi 2. Si accumula il citrato 3. Parte la sintesi degli acidi grassi 4. Si formano i triacilgliceroli 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 22

Effetto dell’aumento NADH/NAD+ e dell’acetil. Co. A 1. 2. 3. 4. 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA Si accumula acetil. Co. A Si attiva la chetogenesi L’acetoacetato si trasforma in beta idrossibutirrato Chetoacidosi alcolica 23

L’eccesso di NADH viene ossidato dalla catena di trasporto degli elettroni 1. Aumenta la sintesi di ATP 2. Aumenta il consumo di ossigeno e la formazione di ROS 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 24

Il destino dell’acetato nel fegato dove l’ATP non è limitante • Si forma acetil Co. A, consumando ATP. Conseguenze: 1. 2. 3. L’acetil. Coa inibisce la piruvato DH L’ADP traina la fosforilazione ossidativa (controllo respiratorio) L’acetil. Co. A entra nella via della biosintesi degli acidi grassi e dei triacilgliceroli 1. 2. Chetogenesi Distribuzione dell’acetato nel sangue ai tessuti (muscoli, cuore, cervello) • Si consuma il Co. A ed esso diventa limitante. Conseguenze: 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 25

L’eccesso di NADH e di acetil. Co. A inibiscono la beta ossidazione degli acidi grassi 1. Si bloccano le deidrogenasi 2. Si accumulano gli acil. Co. A a lunga catena 3. Parte la sintesi degli acidi grassi 4. Si formano i triacilgliceroli 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 26

Nella steatosi epatica i triacilgliceroli si accumulano negli epatociti e poi inizia l’infiammazione (infiltrazione di leucociti) la steatosi si accompagna a epatomegalia 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 27

Il sovvertimento metabolico nell’alcolismo acuto e cronico Aumento della formazione di specie reattive dell’ossigeno ed effetti molecolari 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 28

La formazione di ROS nel metabolismo dell’etanolo 1. 2. A livello della catena di trasporto degli elettroni – – Aumento del rapporto NADH+H+/NAD+ Aumento del trasporto di e- e consumo di O 2 A livello di CYP 2 E 1 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 29

La velocità di produzione di O 2· - è direttamente proporzionale al Δψ 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 30

La reazione di CYP 2 E 1 si possono formare prodotti tossici (in rosso) 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 31

CYP 2 E 1 è inducibile • In presenza del suo substrato (per es. etanolo), il gene CYP 2 E 1 aumenta la sua trascrizione • L’etanolo determina un aumento dell’espressione (e attività specifica) di CYP 2 E 1 • Il metabolismo dell’etanolo causa un aumentata produzione di ROS L’intensità della macchia nera è proporzionale alla quantità di enzima CYP 2 E 1 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 32

Le specie reattive dell’ossigeno e sistemi antiossidanti 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 33

I ROS causano molte malattie croniche perché danneggiano indistantamente le molecole biologiche Diabetes mellitus Neurodegenerative disorders (Parkinson's disease, Alzheimer's disease and Multiple sclerosis), Cardiovascular diseases (atherosclerosis and hypertension) Respiratory diseases (asthma) Cataract development Rheumatoid arthritis Various cancers (colorectal, prostate, breast, lung, bladder cancers). 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 26/11/2019 34

Types of ROS and their free energy ROS formation is exergonic: O 2 ROS superoxide anion, free radical hydrogen peroxide, non radical hydroxyl radical, free radical 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 35

Types of ROS and their half-life reactivity directly depends of their half-life microseconds minutes nanoseconds 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 36

I ROS attaccano le molecole biologiche Lipidi Proteine Acidi nucleici 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 26/11/2019 37

Lipoperossidazione e suoi prodotti • Interessa le catene alcheniche • Si forma un radicale alchenilico • Esso reagisce con l’ossigeno e si forma un radicale perossilico • La catena si spezza si formano malondialdeide (MDA) e 4 idrossinonenale (HNE) 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 38

4 -HNE è un reattivo tri-funzionale Cell death and diseases related to oxidative stress: 4 -hydroxynonenal (HNE) in the balance. Cell Death and Differentiation (2013) 20, 1615– 1630 doi: 10. 1038/cdd. 2013. 138 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 39

4 -HNE è patogenico 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 40

Il 4 -HNE si accumula con l’età 4 -Hydroxy-nonenal—A Bioactive Lipid Peroxidation Product. Biomolecules 2015, 5, 2247 -2337; doi: 10. 3390/biom 5042247 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 41

General types of protein oxidative modification • • • Sulfur oxidation (Cys disulfides, S-thiolation; Met sulfoxide) Protein carbonyls (side chain aldehydes, ketones) Tyrosine crosslinks, chlorination, nitrosation, hydroxylation Tryptophanyl modifications Hydro(pero)xy derivatives of aliphatic amino acids Chloramines, deamination Amino acid interconversions (e. g. , His to Asn; Pro to OH-Pro) Lipid peroxidation adducts (MDA, HNE, acrolein) Amino acid oxidation adducts (e. g. , p-hydroxyphenylacetaldehyde) Glycoxidation adducts (e. g. , carboxymethyllysine) Cross-links, aggregation, peptide bond cleavage 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 26/11/2019 42

Anche i carbonili proteici si accumulano con l’età 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 43

I sistemi enzimatici endogeni di difesa dagli stress ossidativi 1. Superossido dismutasi (SOD) 2. Catalasi (CAT) 3. Glutatione perossidasi e reduttasi (GPx e GR) 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 44

Cos’è il glutatione? • Tripeptide gamma-glutamil cisteinil glicina 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 45

Il ciclo redox del glutatione Reazione di scambio tiolo-disolfuro 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 46

Scavenging enzimatico dei ROS tappa n. 1 La superossido dismutasi trasforma una specie molto reattiva (microsec) in una meno reattiva (min) microseconds minutes nanoseconds 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 47

Il perossido d’idrogeno Una molecola da eliminare il prima possibile Reazione di Fenton Ioni metallici catalizzano la conversione di perossido d’idrogeno in radicale idrossilico emivita di nanosecondi Fe 2+ Fenton reaction Fe 3+ OH- 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 48

Il perossido d’idrogeno Una molecola da eliminare il prima possibile Entrano in azione due enzimi Catalasi e Glutatione perossidasi il perossido d’idrogeno si trasforma in acqua e ossigeno Fe 2+ Fenton reaction Fe 3+ OH- 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 49

La minaccia della reazione di Fenton due enzimi catalizzano il consumo di perossido d’idrogeno CATALASI E GLUTATIONE PEROSSIDASI Vedi prossima slide 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 50

Glutatione perossidasi • Forma citosolica – reagisce con H 2 O 2 che si forma nel citosol (es. CYP 2 E 1) – accoppiata a glutatione reduttasi citosolica • NADPH deriva da ciclo dei pentosi fosfati • Forma mitocondriale – reagisce con H 2 O 2 che si forma nella matrice mitocondriale (es. catena di trasporto degli elettroni) – accoppiata a glutatione reduttasi mitocondriale • NADPH deriva da ciclo dei pentosi fosfati 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 51

La riduzione del glutatione disolfuro nel citosol dipende dalla via dei pentosi fosfati 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 52

La riduzione del glutatione nella matrice dipende dalla transidrogenasi (NNT) si tralascia 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 53

La riduzione del glutatione disolfuro ad opera della vitamina E (liposolubile) e della vitamica C (idrosolubile) e dell’acido lipoico cicli redox di vitamine importanza dell’apporto con la dieta 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 54

L’omeostasi ossidativa è l’equilibrio tra formazione ed eliminazione dei ROS 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 55

Lo squilibrio redox causa malattie 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 56

Fine 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 57

Materiale supplementare 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 58

Dall’abuso di alcol alla al carcinoma epatico BIOCHIMICA: Etanolo MEOS H 2 O 2 HO danni molecolari e cellulari PATOLOGIA GENERALE: flogosi cronica carcinogenesi 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 59

I danni molecolari dovuti all’etanolo e i suoi prodotti del metabolismo Modificazione chimica delle proteine Lipoperossidazione 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 60

26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 61

Il glutatione è importante in tossicologia 26/11/2019 091 FA - BIOCHIMICA APPLICATA MEDICA 62