Lezione 13 ATPasi di trasporto Canali ionici Biosegnalazione

Lezione 13 ATPasi di trasporto Canali ionici Biosegnalazione 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 0

Capitolo 11 Membrane biologiche e trasporto continua

L’energia libera del trasporto • Come nelle reazioni chimiche, anche nei processi di trasporto ci sono differenze (positive o negative) di energia libera (ΔG) • L’equazione del ΔG di trasporto è analoga all’equazione del ΔG di reazione RICHIAMO Equazione della variazione di G in una reazione chimica S P ΔG = ΔG°’ + RT ln ([P]/S]) (libro: eq. 11. 2 ) 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 2

Il ΔG di trasporto Consideriamo il trasporto di una molecola S da un compartimento all’altro (es: intra- ed extra-cellulare, in o ex) Due equazioni diverse: 1. S neutro ΔGt = RT ln ([Sin]/Sex]) (libro: eq. 11. 3) • S carico ΔGt = RT ln ([Sin]/Sex]) + z. FΔΨ (libro: eq. 11. 4) z è la carica netta 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 3

Trasporto eso- o endoergonico? ΔGt = RT ln ([Sin]/Sex]) Trasportiamo S da ex a in, quando il rapporto in/ex è 104. L’equazione ci fa calcolare che ΔGt=23 k. J/mole. Il ΔGt è positivo ENDORGONICO 21/03/2019 - S. Passamonti ln 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 4

Trasporto eso- o endoergonico? ΔGt = RT ln ([Sin]/Sex]) Trasportiamo S da ex a in, quando il rapporto in/ex è 10 -4. L’equazione ci fa calcolare che ΔGt=-23 k. J/mole. Il ΔGt è negativo ESORGONICO 21/03/2019 - S. Passamonti ln 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 5

Se la molecola è carica? Trasporto eso- o endoergonico? ΔGt = RT ln ([Sin]/Sex]) + z. FΔΨ • Trasportiamo S- da ex a in, quando il rapporto in/ex è 104. • In questo caso dobbiamo anche conoscere il potenziale di membrana (Vm= 0, 050 V, negativo interno) • Al valore ΔGt=23 k. J/mole dobbiamo aggiungere 1 x 96, 5* x 0, 05 = 4, 8. ΔGt=23+4, 8 = 27, 8 k. J/mole • Se la molecola è monoanionica e deve essere trasportata contro gradiente di concentrazione e contro gradiente di potenziale elettrico, Il ΔGt è maggiore che nel caso di S neutra *F=96, 5 k. J/V 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 6

I trasportatori attivi primari • Sono bi-funzionali: – catalisi topologica trasporto di molecole da un compartimento all’altro – catalisi enzimatica idrolisi dell’ATP ATP+H 2 O ADP+Pi • Possono essere bi-direzionali – IMPORTANTE: in un caso, il trasporto di H+ guida la sintesi di ATP L’idrolisi dell’ATP è esoergonica e rende possibile il trasporto endoergonico (contro gradiente) • SINONIMI: ATPasi di trasporto, pompe 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 7

le ATPasi di trasporto 4 tipi • Tipo P – si forma un intermedio fosforilato covalente • Tipo V – presenti nei vacuoli cellulari • Tipo F – un tempo chiamate "Fo. F 1” • ABC – trasportatori con il dominio ATP-binding cassette 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 8

Consideriamo solo i casi in colore 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 9

Le ATPasi di trasporto - tipi P e V Tipo P • pompano cationi (H+, Na+, Cu+, Mg++, Ca++) all’esterno della cellula • pompa Ca++ nel reticolo sarcoplasmatico Tipo V • pompa H+ nel vacuolo (lisosomi, endosomi, vescicole di secrezione) o all’esterno 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 10

Le ATPasi di trasporto - tipi F Tipo FM • Sintetizza ATP, sfruttando il trasporto di H+ dal citosol/spazio intermembrana alla matrice: è un motore molecolare • pompa Ca++ nel reticolo sarcoplasmatico Tipo FP • Idrolizza ATP ad ADP + Pi s livello di membrana plasmatica, in funzioni complesse di regolazione 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 11

Le ATPasi di trasporto - tipi ABC Trasportano endo- e xenobiotici • Endobiotici – molecole endogene o comunque che partecipano al metabolismo e funzioni cellualari (come le vitamine) • Xenobiotici – molecole non naturai o sintetizzate solo nelle piante e eliminate 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 12

D. L. Nelson, M. M. Cox, Introduzione alla biochimica di Lehninger-Sesta edizio ne, Zanichelli editore 2018 13

Il vanadato è un inibitore dello stato di trasizione delle ATPasi di trasporto, tipo P 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 14

La pompa SERCA sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) • E’ la pompa del calcio localizzata nel reticolo sarcoplasmatico dei muscoli cardiaci e scheletrici. • Pompa il calcio dal citosol al reticolo sarcoplasmatico – mantiene bassa la [Ca++] intracellulare 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 15

Singolo polipeptide 1043 amminoacidi, 7 TMD, sito di legame per l’ATP, dominio di fosforilazion, gruppi R che legano il calcio (in nero) 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 16

Il ciclo catalitico della pompa SERCA 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 17

La relazione struttura-funzione di SERCA 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 18

La pompa Na+/K+ ATPasi • Localizzata sulla membrana plasmatica della cellula • ubiquitaria FUNZIONI • pompa all’esterno 3 Na+ • pompa all’interno 2 K+ è un antiporto elettrogenico • mantiene l’equilibrio osmotico – pompa Na+ all’esterno per compensare gli anioni fissi intracellulari (proteine, ac. nucleici) • mantiene il potenziale di membrana negativo all’interno (Vm = - 50 -70 m. V), utilizzato per compiere lavoro: – potenziale d’azione nelle cellule eccitabili (nervose e muscolari – driving force per cotrasporto / trasporto attivo secondario 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 19

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La pompa Na+/K+ ATPasi è un eterodi(tri)mero 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 21

La pompa Na+/K+ ATPasi • • • subunità α (p. m. circa 100. 000) subunità β (p. m. circa 55. 000). siti di legame: • 3 siti intracellulari, uno per legare gli ioni sodio (3 Na +) e ATP e un sito di fosforilazione. • 2 siti extracellulari, uno per legare gli ioni di potassio (2 K +) e l'ouabain. 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 22

La struttura quaternaria della pompa sodio-potassio ATPasi 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 23

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Le aquaporine (AQP) • Sono canali specifici per l’acqua, e altre molecole molto polari come il glicerolo e l’urea, o gas • Omotetrameri • Ogni subunità (p. m. 30000) è costituita da: – sei eliche a elica transmembrana (M 1, M 2, M 4 -M 7 e M 8) – due mezze eliche (M 3 e M 7) – cinque anelli di connessione attorno ad un poro acquoso 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 25

AQP monomero (a e b) o tetramero (c) gas ? acqua 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 26

Il poro acquoso di AQP è <0, 3 nm le molecole di acqua passano in fila il trasporto non è controllato (no gating) inibito da reagenti dei tioli (cisteine), come Hg. Cl 2 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 27

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Capitolo 12 Biosegnalazione

La traduzione del segnale • La cellula registra le variazioni ambientali a livello della membrana plasmatica, dove sono espresse proteine di membrana che agiscono da recettori specifici • Questi recettori attivano la generazione di molecole di segnale all’interno della cellula La cellula trasduce i segnali extracellulari con una reazione chimica intracellulare 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 30

Caratteristiche -1 SPECIFICITÀ • interazioni molecolari con il recettore – analoghe alle interazioni di un enzima/trasportatore con il substrato rete di legami deboli • espressione selettiva del recettore su tipi cellulari – base molecolare del differenziamento cellulare e tissutale 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 31

Caratteristiche -2 SENSIBILITÀ • Il recettore ha elevata affinità con la molecola di segnale extracellualre (ligando, L; per es. un ormone – < Kd= 10 -7 M (n. M, ma attivabile anche a [L]=p. M) • Il recettore lega L in modo cooperativo – a basse [L] il recettore si attiva e determina una risposta biologica amplificata 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 32

Caratteristiche -3 AMPLIFICAZIONE • Il complesso recettore-ligando (n=1) causa la generazione di numerose molecole di segnale intracellulari (n>>1) – attiva un enzima intracellulare che catalizza una reazione chimica, il cui prodotto è una molecola di segnale (per es. AMPc) – può seguire una cascata di attivazione enzimatica • si attivano diversi enzimi, uno dopo l’altro 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 33

Caratteristiche -4 PROTEINE DI SEGNALAZIONE • Associate al recettore, ci sono delle proteine di segnalazione, aventi domini proteici modulari – sono domini comuni a diverse proteine ( omologia di sequenza localizzata), per es. il dominio di fosforilazione, o di legame a PIP 3 – alcuni domini consentono alle proteine di segnalazione di associarsi alle proteine di sostegno (citoscheletro) compartimentazione subcellulare 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 34

Caratteristiche -5 DESENSIBILIZZAZIONE • Il complesso recettore-ligando va incontro a inattivazione – la risposta biologica si esaurisce, pur in presenza dello stimolo esterno 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 35

Caratteristiche -6 INTEGRAZIONE • Diversi recettori possono essere attivati simultaneamente • le molecole di segnale intracellulare generate da ogni recettore interagiscono tra di loro – la risposta biologica può essere: • potenziata • attenuata • diversificata 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 36

Caratteristiche -7 LOCALIZZAZIONE • Diversi recettori e le rispettive proteine di segnale intracellulari possono essere confinati in comparti/zone subcellulari – interazioni con le proteine di sostegno – interazioni con le zattere di membrana – ecc. 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 37

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4 tipi di recettori 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 39

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Fine A lunedì • Traduzione del segnale 21/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 41