Lesame emocromocitometrico EE tra gli esami di laboratorio

L’esame emocromocitometrico (EE) è tra gli esami di laboratorio più richiesti per valutare lo stato di salute generale di un individuo. Esso fornisce indicazioni su numero e dimensioni di globuli bianchi, globuli rossi, piastrine, nonché sul contenuto di emoglobina nei globuli rossi e sul rapporto di questi con la componente liquida. All’EE si associa di routine la formula leucocitaria che fornisce indicazioni numeriche delle diverse popolazioni leucocitarie (neutrofili, linfociti, monociti, eosinofili, basofili). Attualmente l’EE viene effettuato utilizzando analizzatori ematologici automatizzati in grado di: 1. 2. 3. 4. Determinare il volume cellulare Determinare il numero cellulare Determinare la conta differenziale dei leucociti Determinare la concentrazione di emoglobina

Metodi di conteggio ematologici L’analisi quantitativa o conteggio degli elementi corpuscolati del sangue può essere effettuato : • con metodo manuale, per conteggio diretto degli elementi al M. O. , previa esatta diluizione del campione di sangue in provetta (o in una apposita micropipetta) con soluzioni neutre isotoniche e successiva deposizione in camere contaglobuli (Thoma-Zeiss, Burker, Neuebauer, ecc. . ) • con metodo automatico, mediante l’impiego di contaglobuli elettronici

Definizione di emocromo Analisi quantitativa e qualitativa degli elementi corpuscolati del sangue Eritrociti Conteggio Leucociti Piastrine Determinazione Emoglobina Ematocrito Analisi quantitative Analisi qualitative Morfologia eritrocitaria Morfologia piastrinica Morfologia leucocitaria Formula leucocitaria

L’esame emocromocitometrico è anche definito emocromo che letteralmente significa misurazione del colore del sangue e del numero delle sue cellule. Di fatto questo esame consente di determinare: - il numero di tutte le cellule del sangue, cioè globuli rossi (eritrociti), globuli bianchi (leucociti) e piastrine (trombociti); - la formula leucocitaria, ossia la percentuale dei diversi tipi di globuli bianchi: neutrofili, linfociti, monociti, eosinofili e basofili; - la concentrazione dell’emoglobina, la proteina dei globuli rossi che trasporta l’ossigeno ai vari tessuti del corpo; - l’ematocrito, che è il volume di globuli rossi contenuto in 100 ml di sangue: per esempio, se l’ematocrito è 40 significa che ci sono 40 ml di globuli rossi in 100 ml di sangue; - l’analisi delle caratteristiche fisiche (forma, dimensioni) dei globuli rossi e delle piastrine. Queste sono indicate da speciali parametri come MCV (misura delle dimensioni medie di un globulo rosso), MCH (indica la quantità media di emoglobina contenuta in un globulo rosso), MCHC (indica la concentrazione di emoglobina in un globulo rosso), RDW (indica le variazioni delle dimensioni dei globuli rossi) e MPV (misura delle dimensioni medie di una piastrina).

Parametro Nome Valori di riferimento Cause di anormalità infezioni; leucemie; processi infiamm. WBC White Blood Cells 4 -11 x 103/ l; 60% neutr. ; 30% linf. ; 5% mono; 4%eosino. ; 1% basof. RBC Red Blood Cells 4. 5 -5. 5 x 106/ l 4 -5 x 106/ l HGB Hemoglobin HCT Hematocrit MCV Mean Corpuscular Volume MCH Mean Corpuscular Hemogl. RDW Red Cell Distribution 11 -16% Width Anemia sideropenica e megaloblastica PLT Platelets Aplasia, leucemie, CID MPV Mean Platelet Vol. 12 -15 g/dl 40 -50% 35 -45% 80 -97 fl 25 -34 pg 150 -400 x 103/ l 7 -10 f. L anemie; leucemie anemie; emoconcentrazione -talassemia; sideropenia; deficit B 12/folato Anemie ipocromiche piastrinopatie

Emocromo e fattori a lungo termine • Età: – Numero dei G. R. , Ht e Hb, elevati alla nascita, decrescono progressivamente fino a raggiungere i livelli più bassi a 2 mesi. Poi riprendono ad aumentare sino ai valori degli adulti tra i 12 e i 15 anni. • Sesso: – Nelle donne il numero dei G. R. , l’Hb e l’Ht sono più bassi del 5 – 10% rispetto a quelli degli uomini • Gravidanza: – Il numero dei G. R. , l’Ht e l’Hb diminuiscono anche per aumento della massa liquida circolante. Inoltre è presente una modesta leucocitosi con neutrofilia.

Modalità di Analisi degli analizzatori di Ematologia • Il sangue intero viene fatto aspirare dallo strumento, che provvede automaticamente ad aliquotarlo con una valvola campionatrice in quantità distinte e a diluire ciascuna quantità per i conteggi e le analisi dei parametri ematologici • I conteggi e le analisi dei parametri ematologici sono effettuate in camere di lettura differenziate, applicando metodi/principi di analisi diversi

Metodo per il conteggio di WBC, RBC e PLT • MANUALE: effettuato a microscopio in camere di conteggio dedicate, su campioni di sangue trattati e diluiti manualmente. – LIMITAZIONI: • Scarsa precisione, per il ridotto numero di cellule contate e le tecniche manuali di preparazione del campione. • Tempo • Preparazione ed Esperienza dell’operatore • AUTOMATIZZATO: eseguito dai contaglobuli su campioni di sangue intero trattati e diluiti automaticamente, con Principio Impedenziometrico – VANTAGGI • Elevata precisione e accuratezza: alto numero di cellule contate e automazione • Velocità di analisi (fino a 150 emocromi/ora)

Principio Impedenziometrico Coulter • Principio: Si basa sul fatto che le cellule sono cattivi conduttori di elettricità mentre il diluente è ottimo conduttore. • Funzionamento: 1)Diluiz. sangue in soluz. elettrolitica isotonica tamponata 2) Aspirazione del campione attraverso orifizi di diametro specifico 3) Mantenimento corrente costante tra due elettrodi (uno esterno ed uno interno rispetto alle camere di conta)

Metodo Coulter Ogni cellula che attraversa l’apertura del campo elettrico sostituisce un volume di diluente pari alle sue dimensioni. Ogni cellula provoca un cambiamento di corrente generando un impulso elettrico misurabile.

Principio Impedenziometrico Coulter 75 f L 70 f L 65 f L 60 f L 55 f L 50 f L • Il passaggio della cellula attraverso il campo elettrico produce un impulso la cui ampiezza è direttamente proporzionale al suo volume. • Il numero di impulsi registrati consente il conteggio degli elementi cellulari • L’analisi della ampiezza degli impulsi consente la differenziazione delle cellule che hanno prodotto gli impulsi

Istogrammi dimensionali Relative Number Histogram 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Femtoliters • L’analisi volumetrica degli impulsi consente di costruire un istogramma dimensionale relativo a ciascuna popolazione cellulare (WBC, RBC, PLT) • Particolari tecnologie brevettate consentono di garantire la massima accuratezza di analisi

Conteggio RBC e Piastrine • Il conteggio e il dimensionamento volumetrico di RBC e PLT viene eseguito nella stessa camera di lettura, con Principio Impedenziometrico • L’analisi dimensionale degli impulsi, con specifiche soglie volumetriche, consente di differenziare i RBC dalle PLT

Analisi RBC MCV = average size of all the cells in the histogram. RDW = standard deviation x 100 Mean Size • Gli impulsi compresi tra 36 e 360 f. L sono classificati come RBC e vengono distribuiti su un istogramma dimensionale suddiviso in 256 canali volumetrici (1, 3 f. L /canale) • Dall’istogramma RBC viene eseguita la misurazione del MCV e del RDW MCV: Volume Medio dei Globuli Rossi, utile nella classificazione delle anemie (micro-, normo- macrocitiche RDW: Ampiezza della distribuzione dei Globuli Rossi,

Analisi RBC: parametri calcolati • MCH = Hb x 10 RBC MCHC= Hb x 100 HCT = MCV X BC HCT 10 • MCH = Contenuto Medio di Emoglobina nei RBC. Particolarmente utile nella classificazione delle anemie (ipo- o normo- cromiche) in associazione al parametro MCHC • MCHC= Concentrazione cellulare Media di Emoglobina. Particolarmente utile nella classificazione delle anemie (ipo- o normo- cromiche) in associazione al parametro MCH • HCT= Ematocrito, esprime la % di volume occupata dai RBC nel volume totale di sangue intero.

Analisi Morfologia RBC • • • Anisocitosi +, +++ Microcitosi +, +++ Macrocitosi +, +++ Ipocromia +, +++ Poikilocitosi +, +++ Doppia Popolazione RBC • Micro RBC/Frammenti RBC • Agglutinazione RBC • L’analisi dei parametri eritrocitari (MCV, MCHC, HCT, RDW) associata alla valutazione dell’istogramma RBC consente agli analizzatori di fornire utili flags di anormalità morfologiche • Tali flag sono utili al laboratorio nella valutazione al microscopio degli strisci di sangue periferico

Analisi PLT #1 - Vengono raccolti i dati del triplice conteggio ed elaborato un primo istogramma con soglie da 2 fl a 20 fl. – Limite inferiore di 2 fl. Rimuove interferenze da noise elettronico – Limite superiore di 20 fl. Assicura che non vengano contati microciti e frammenti RBC

Analisi PLT: parametri calcolati • Dall’istogramma PLT vengono derivati ulteriori parametri quali: – PCT (ematocrito Piastrine) – MPV (Volume Medio PLT) – PDW (Ampiezza Distribuzione PLT, indice di Anisocitosi Piastrinica) • L’analisi dei parametri PLT (PCT, MPV, PDW) associata alla valutazione dell’istogramma PLT, RBC, WBC consente agli analizzatori di fornire utili flag di anormalità morfologiche, quali: – AGGREGATI PLT – PIASTRINE GIGANTI – TROMBOCITOPENIA, TROMBOCITOSI

ISTOGRAMMA PLT -NORMALE Conteggiate da 2 a 20 f. L Platelet Distribution Width S. D. (MPV) PDW = ------MPV x 100 Small Platelet MPV < 7 f. L Large Platelet MPV > 11 f. L Giant Platelet MPV > 20 f. L Valori di riferimento PLT: MPV: PCT: PDW: 140 -440 x 10^9/L 7. 4 -10. 4 f. L 0, 150 -0, 320 % 15. 5 -17. 5

Determinazione Hb Misura in Spettrofotometria dopo trasformazione dell’ Hb in Cianmetaemoglina, con reagente specifico, dedicato • Metodica: – Reagente Hb Modificato, ottimizzato per eliminare interferenze di Sulfoemoglobina – Misura fotometrica della Assorbanza campione. Filtro ad ampia banda, con valore centrale @ 525 nm. – Filtro Infrarosso per assorbimento calore – Misura del Bianco ad ogni campione

Conteggio Globuli Bianchi Y X 35 50 f. L • Il campione diluito viene trattato con un particolare reagente che provoca la lisi completa dei RBC • Tutti gli impulsi registrati con volume superiore a 35 fl. sono classificati e contati come Globuli Bianchi • Tutti gli impulsi registrati con volume inferiore a 35 fl. sono classificati e registrati come Piastrine o frammenti RBC lisati ed esclusi dal conteggio

Tecnologia VCS Analisi volumetrica Volume Analisi strutturale Complessità cellulare interna Conduttività Studio di dispersione della luce laser Granulazioni interne Superificie cellulare Scatter luce laser

Volume Cellulare (IMPEDENZIOMETRIA) Densità del Nucleo, Rapporto Nucleo/Citoplasma (CONDUTTIVITA’) Granulazioni Citoplasmatiche (SCATTER DI LUCE LASER) Tanto maggiore è la complessità cellulare tanto più elevata è la resistenza opposta dalla cellula al passaggio di corrente, e quindi tanto maggiore è la sua opacità. Tra gli elementi strutturali interni della cellula, il nucleo è quello con più bassa resistenza ed è quindi un ottimo conduttore di corrente. Cellule con elevato rapporto N/C (Linfociti) hanno una Opacità minore di cellule con rapporto N/C ridotto (Granulociti). La misura dello scatter di luce laser, combinata alle misure di Impedenza e Conduttività/Opacità, consente una classificazione completa delle popolazioni leucocitarie in base alle peculiari caratteristiche: volume cellulare, grandezza e densità del nucleo, rapporto N/C, granularità e superficie cellulare.

Tecnologia VCS – Formula Leucocitaria – Tutte le cinque popolazioni sono contate direttamente, senza calcoli o derivazioni matematiche – TRE diverse tecnologie di indagine applicate simultaneamente – Definizione delle popolazioni cellulari (cluster) con tecnologia Accu. Gate – Conservazione delle cellule allo stato NATIVO V - VOLUME C - CONDUTTIVITA’/OPACITA’ S - SCATTER DI LUCE LASER

Sofisticato sistema di separazione delle popolazioni cellulari, mediante Accu. Gate LINFOCITI NEUTROFILI BASOFILI MONOCITI EOSINOFILI

Visione della Parte numerica Anomalie Quantitative dei Leucociti Possibile definirle molto bene in funzione della estrema precisione nel conteggio TOTALE E DIFFERENZIALE dei Leucociti e diagnosticabili in funzione dei Valori Assoluti delle cellule • Neutropenie • Linfocitopenie • • • Neutrofilie Eosinofilie Basofilie Linfocitosi Monocitosi

EDTA • La concentrazione del sale di- o tripotassico raccomandata è di 1, 5 ± 0, 25 mg/m. L di sangue. • Un eccesso di EDTA altera sia gli eritrociti che i leucociti provocando concentrazione e alterazioni degenerative. • Una quantità di EDTA superiore a 2 mg per m. L di sangue può portare ad una significativa diminuzione dell’ematocrito e ad un aumento dell’MCHC. • Anche le piastrine risentono dell’eccesso di EDTA (rigonfiamento e disintegrazione, aumento artificiale del numero delle piastrine perché i frammenti sono così grossi da essere contati come piastrine morfologicamente normali).

Pseudopiastrinopenie Sono causate da aggregazioni in vitro delle piastrine, un artefatto determinato da varie cause CAUSE PREANALITICHE • Accesso alla vena difficoltoso • Concentrazione ridotta di anticoagulante • Satellitismo piastrinico (Adesione delle piastrine ai Gr. Neutrofili) • Aggregazioni da uso di anticoagulanti EDTA-K 3

Satellitismo Piastrinico Il Satellitismo piastrinico è un fenomeno abbastanza raro che si osserva in alcuni campioni di sangue a contatto con EDTA e conservato a Temperatura ambiente. Consiste nella formazione di rosette con al centro un Granulocita neutrofilo circondato da Piastrine. Al conteggio automatizzato si osserva sempre una piastrinopenia

I lipidi nel sangue sono rappresentati essenzialmente dai fosfolipidi, dai trigliceridi, e dal colesterolo libero ed esterificato. A causa delle loro proprietà idrofobe, i lipidi nel sangue non sono allo stato di dispersione molecolare, ma aggregati a specifiche proteine di trasporto: le apolipoproteine. Le lipoproteine derivanti dall’associazione delle apolipoproteine e dei lipidi costituiscono un sistema eterogeneo.

• Il colesterolo è uno steroide con 27 C disposti in una struttura a 4 anelli carbociclici condensati. • Componente delle membrane cellulari • Precursore per – Acidi biliari – Vitamina D – Ormoni steroidei

• trigliceridi o acilgliceroli sono molecole composte dal glicerolo e da uno, due, o tre acidi grassi (monogliceridi, digliceridi o trigliceridi)

Il dosaggio lipidico • Il colesterolo ed i suoi esteri, liberati dalle lipoproteine mediante l’azione di detergenti, vengono prima idrolizzati in una reazione catalizzata dalla colesterolo-esterasi e poi ossidati ad opera della colesterolo-ossidasi. Il perossido di idrogeno che si forma durante l’ossidazione, viene misurato con l’aggiunta di una perossidasi e di un cromogeno: la concentrazione del composto viene misurata con lo spettrofotometro (546 nm). • La determinazione dei trigliceridi prevede l’azione di speciali lipasi che idrolizzano i trigliceridi in glicerolo ed acidi grassi liberi; il glicerolo viene ulteriormente trasformato in diidrossiacetonfosfato e H 2 O 2 ; anche in questo caso la concentrazione di H 2 O 2 viene misurata con lo spettrofotometro (lunghezza d’onda 546 nm). • Le concentrazioni sono espresse in mg/dl.

DOSAGGI Colesterolo totale (libero e esterificato): Metodo spettrofotometrico con reazione enzimatica (col. ossidasi) e produzione di un prodotto colorato (Chinonimina-reazione di Trinder). Colesterolo-HDL: Ultracentrifugazione, precipitazione, separazione delle frazioni LDL e VLDL e determinazione del colesterolo-HDL con il metodo spettrofotometrico. Colesterolo-LDL: Se i trigliceridi sono normali o 400 mg/dl non occorre dosarlo poiché il suo valore può essere calcolato con la formula di Friedewald: LDL = colesterolo totale – (HDL + 1/5 trigliceridi) Quando il valore dei trigliceridi supera 400 mg/dl, la formula di Friedewald non è attendibile ed è pertanto necessario eseguire la determinazione del colesterolo LDL con metodiche di ultracentrifugazione. Trigliceridi: Idrolisi enzimatica (lipasi) ac. grassi e glicerolo e dosaggio glicerolo con metodo enzimatico Apolipoproteine: immunoassay (ELISA/RIA)

Il profilo lipidico ideale I livelli dei lipidi plasmatici variano significativamente nelle diverse popolazioni in rapporto a fattori genetici oltre che ambientali, in particolare l’alimentazione. È quindi difficile definire dei valori "normali"; piuttosto i grandi trials condotti negli ultimi anni e le diverse organizzazioni e gruppi di studio internazionali hanno individuato dei valori "accettabili" in quanto correlati ad un minor rischio cardiovascolare e quindi "auspicabili", e valori invece al di sopra dei quali il rischio aumenta progressivamente da moderato ad elevato. La definizione di questi limiti è di fondamentale importanza per decidere la successiva strategia diagnostica e terapeutica. Sono "auspicabili" valori di colesterolo totale inferiori a 200 mg/dl e di colesterolo LDL inferiori a 130 mg/dl. Sono considerati valori "limite" per il colesterolo totale quelli compresi tra 200 e 239 mg/dl e per il colesterolo LDL tra 130 e 159 mg/dl. Valori superiori a questi sono definiti "elevati" e si associano ad alto rischio di sviluppare cardiopatia ischemica. Sono "auspicabili" valori di colesterolo HDL compresi tra 40 e 60 mg/dl; per i trigliceridi sono "auspicabili" valori inferiori a 200 mg/dl, "limite" valori tra 200 e 400 mg/dl ed "elevati" valori sopra i 400 mg/dl.

VALORI IDEALI/DESIDERABILI Colesterolemia inferiore a 200 mg/dl HDL-colesterolo non inferiore a 40 mg/dl LDL-colesterolo non superiore a 130 mg/dl Trigliceridemia inferiore a 200 mg/dl

Lipoproteine Complessi lipoproteici circolanti, formati da trigliceridi, colesterolo, fosfolipidi e proteine Si classificano: - in base alla migrazione elettroforetica, in -lipoproteine (HDL), pre -lipoproteine (VLDL) e -lipoproteine (LDL) - in base alla densità, mediante l’ultracentrifugazione preparativa, in chilomicroni, VLDL, LDL e HDL

Lo studio delle lipoproteine consiste nella definizione del valore percentuale delle diverse frazioni lipoproteiche ed eventualmente dei lori reciproci rapporti quantitativi. La separazione tra le diverse classi viene effettuata sulla base delle diverse caratteristiche chimico-fisiche. Ultracentrifugazione: Il contenuto lipidico conferisce alle lipoproteine una densità più bassa rispetto a quella delle altre proteine plasmatiche, inoltre ogni classe di lipoproteine ha una diversa densità. Elettroforesi: È una tecnica di separazione basata sulla diversa velocità di migrazione delle lipoproteine sottoposte ad un campo elettrico. La mobilità elettroforetica, in base alla quale le lipoproteine possono essere separate e classificate, è influenzata dalla natura del mezzo in cui avviene la migrazione, dalle caratteristiche del campo elettrico applicato, dalla massa, dalle dimensioni, dalla carica e dalla forma delle varie lipoproteine: i chilomicroni, se presenti, rimangono all’origine, le altre lipoproteine migrano a velocità che aumentano secondo il seguente ordine: LDL <VLDL < HDL. Il mezzo di supporto più comunemente utilizzato è il gel di agarosio. Le lipoproteine sono rese visibili mediante coloranti lipofili (Oil Red O, Fat Red 7 B, Sudan Black B). Misura della concentrazione delle apoproteine: Le apoproteine possono essere analizzate con metodiche quantitative o qualitative di tipo immunometrico.

FENOTIPO LIPOPROTEINE AUMENTATE I CHILOMICRONI IIA LDL IIB LDL E VLDL III BETA-VLDL IV VLDL V CHILOMICRONI VLDL E Il lipidogramma elettroforetico consente di diagnosticare i vari tipi di Fredrickson

Deficienze familiari di lipoproteine Morbo di Tangier, viene trasmesso come carattere autosomico recessivo. E’ sostenuto da un deficit strutturale dell’apolipoproteina AI e da una difettosa rimozione del colesterolo dai tessuti periferici. Il morbo di Tangier è riconoscibile dai seguenti rilievi: Colesterolemia inferiore a 100 mg/dl e trigliceridemia normale; Assenza delle lipoproteine HDL (apo AI). La abetalipoproteinemia, viene trasmessa come carattere autosomico recessivo. La mancata sintesi epatica ed intestinale di apolipoproteine B condiziona una sindrome da malassorbimento con gravi effetti secondari. Esami di laboratorio tipici: Colesterolemia inferiore a 100 mg/dl e trigliceridemia inferiore a 30 mg/dl; Totale assenza delle lipoproteine contenenti apolipoproteina B (Chilomicroni, VLDL, LDL).

E ora mi tocca studiare…! A proposito…. Quando vi sono gli esami…? !? Lunedi 5 Luglio e Martedi 27 Luglio Ore 9 a Caserta

Grazie per la Vostra Attenzione e…. . Arrivederci agli Esami…. . !!!!